AP様、早速コメントいただきまして、ありがとうございます。
Mgイオンにそのような作用があることは知りませんでした。MgCl2を加えてみることにします。ありがとうございます。
おお様、ありがとうございます。
＞核膜の成分は細胞膜の成分と一緒なのになぜ核膜は大丈夫なのかとなぜそのときに聞けないのかというのも不思議だ。
知りませんでした。。。そうだったのですね。大変お恥ずかしいです。
＞核をつかった研究で核膜を溶かすために１％ Tritonを使うことはよくある。それで溶けなかった成分は核膜を裏打ちしていたり核内の構造を保つ核マトリクス、クロマチンや一部の核蛋白。蛋白によりけりだけど１％Tritonで溶出する核蛋白質もある。
勉強になります。。。ありがとうございます。
0.1％トリトンX100で検討してみます。
AP様、引き続きありがとうございます。
＞おおさんの言うとおり1% Tx-100は濃いような気もするけど、先にも書いたけれど、核が壊れると一気にドロッとするのでわかるはず。やってみてどうですか。上清はさらさらですか？
実は私は培養細胞のウエスタンを5年ほどやってきています。組成は1％トリトンX100ですが、これまで一度も上清に粘り気を生じたことはありませんでした。何度か細胞のペレットにSDSサンプルバッファーを加えて速やかに酵素活性を潰したい時がありましたが、その時には非常に粘度の濃いものができました。これは核膜がSDSにより破壊され、ゲノムがでてきてしまった、と思っていました。このような場合、ソニケーションによりサラサラにしていました。
ということで、1％トリトンX100は核膜が壊れない＝ゲノムが出てこれないと考えていました。ですが、そうではなさそうですね。
低張バッファーは膜分画を回収しようとした時作製したことがありますが、一度0.1％トリトンX100で核とそうで無い分画を分離したいと思います。
0.1％トリトンX100で上手に核を除くことができれば、上清から免疫沈降をしたいんです。
その場合、膜をしっかり可溶化するため、トリトンX100の終濃度を1％にあげた方がよさそうですよね？
みなさまからご助言をいただき、本当に感謝しています。
一度自分の方でもしっかり文献なりプロトコルを調べるということが必要だと気づくことができました。
ありがとうございます。 |
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