医学系の大学院生3年生です。
スプライス異常を有する患者検体や細胞株検体の
cDNAに対してPCRをかけることがよくあるのですが、
パターンが2通りしか想定されないにもかかわらず、
バンドが3本出るということがほぼ毎回見られています。
切り出し精製してSangerシーケンスで配列を見てみると、
1番サイズの小さいバンドと2番目に小さいバンドが
それぞれ想定通りの2通りのパターンの配列になっていて、
3番目のバンドはそれらの重なった配列になっています。
たとえば、ある遺伝子のExon3、4、5、6が読めるようにプライマーを設計し、
Exon4がスキップされるような異常が片アレルに起きているとすると、
小さいバンド（Exon3、5、6）と大きいバンド（Exon3、4、5、6）の他に、
さらに大きいサイズの所にバンドがあり、
配列を読んでみるとその2つが重なった配列になっています。
つまりForwardで読むとExon3までは一緒で、その後Exon4〜とExon5〜が
ほぼ1:1の波高で重なっており、
Reverseで読むとExon6、5までは一緒でその後Exon4〜とExon3〜が
やはりほぼ1:1の波高で重なっています。
切り出しの際にバンド間の距離はしっかり取っており、
混入することはないと思います。
また配列からはgDNAの混入も否定的です。
可能性として考えているのは、スプライス異常のある鎖とない鎖が
PCRの過程でミスアニールしていて、配列の合わない部分
（上記の例でいうとExon4）が片方の鎖で余剰としてループのようになっていて、
そのせいで泳動で流れづらく、サイズの大きいバンドとして
検出される、ということが起きているのではないかと疑っています。
しかし、そのような現象はよくあるのでしょうか？
教科書や論文、googleで何となく調べた範囲だとわかりませんでした。
皆さまのご経験や、あるいはそれに関して記載のある教科書など、
何かあればお教えいただけますと幸いです。
よろしくお願いいたします。 |
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