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(無題) 削除/引用 No.6856-7 - 2018/04/21 (土) 05:53:59 - おお もしかしたら非特異的というか、非生理的か生理的にはわかっていないような分子間S-S結合かもしれません。細胞外は細胞内に比べて比較的酸化的な環境ですし。たとえばアルブミンとかCysリッチな蛋白とかくっついてしまっているとか。 なにか還元状態でも検出できそうな抗体がほしいような気がしてきました。

(無題) 削除/引用 No.6856-6 - 2018/04/21 (土) 00:22:44 - ma おおさん、 情報ありがとうございます。 今、血中タンパク質がglycationが起こるとバンドがどうなるかを調べているところです。 認められたのはかなりのバンドシフトですので、分子量がかなりあるものか、電荷が影響していることを考えています。 > これがよくわからないけど、還元したサンプルをSDSPAGEしてTransferした膜上で抗体の結合が弱いということですか？ たしかに、この文だけだとよくわからないですね。 ラボでは多くのFc融合タンパク質を発現させて、anti-Fc antibodyで検出していますが、現在試した4種類の抗体ではどれも、非還元状態で検出がよく、還元状態でかなり検出が落ちます（<10倍以上）。 おそらく、抗体が二量体か、二量体に特有の構造を認識しやすいためだと思っていました。 マウス血清だけを流しても、この抗体はマウスのIGGですらクロスしませんので、目的タンパク質特有だと思っています。 >[Re:4] おおさんは書きました : > glycation? > > ＞還元状態で流すと、抗体のアフィニティーが弱いのか、かなり検出が弱いですが、 > > これがよくわからないけど、還元したサンプルをSDSPAGEしてTransferした膜上で抗体の結合が弱いということですか？ > > 投与する前の薬剤タンパク質は流してますか？

(無題) 削除/引用 No.6856-5 - 2018/04/20 (金) 08:32:26 - おお 薬剤を投与してないマウス血清のWBでなにか見られますか？

(無題) 削除/引用 No.6856-4 - 2018/04/20 (金) 08:30:38 - おお glycation? ＞還元状態で流すと、抗体のアフィニティーが弱いのか、かなり検出が弱いですが、 これがよくわからないけど、還元したサンプルをSDSPAGEしてTransferした膜上で抗体の結合が弱いということですか？ 投与する前の薬剤タンパク質は流してますか？

(無題) 削除/引用 No.6856-3 - 2018/04/20 (金) 05:27:34 - ma Sulfさん、 ご意見ありがとうございます。 metは配列中にはそれほど顕著にあるわけではないのですが、その可能性も検討したいと思います。 ラボでの話し合いで、マウス血清を直接タンパク質とインキュベートする実験をしたのですが、同じようにラダー状のバンドが認められました。 vivoで肝臓とかで代謝されてそうなっているわけではなさそうです。 >[Re:2] Sulfさんは書きました : > Oxidation？とくにMet-richなタンパク質なんかだとありえます。

(無題) 削除/引用 No.6856-2 - 2018/04/19 (木) 08:52:12 - Sulf Oxidation？とくにMet-richなタンパク質なんかだとありえます。

マウス血中でのタンパク質の修飾？ 削除/引用 No.6856-1 - 2018/04/19 (木) 02:43:22 - ma どうしてもよくわからないことがあり質問させてください。 最近ある薬剤タンパク質をマウスに注入して、薬剤の安定性をみる実験をしたのですが、ELISAを使った検出では顕著な減少が確認されました。 念のため、血中サンプルを使ってウェスタンをしてみると、分解していると思っていたものが、上方にバンドがシフトしているようです。 もともとダイマーで150kDaほどのFc融合タンパク質ですが、時間経過とともにこの150kDaバンドは薄くなり、その代わりおよそ200kDaのところにはっきりとバンドが確認できます。よく見るとさらに250kDaぐらいのところにもバンドが現れます。高分子ですので、正確な分子量は現在はっきりとしていませんが、まるで細胞質のユビキチン化みたいにラダーが見られます。 還元状態で流すと、抗体のアフィニティーが弱いのか、かなり検出が弱いですが、うっすらとバンドシフトが見られます。 一体これが何なのか、何かの修飾が起こっているのか、もし同様な経験のある方や、何らかの考えがありましたら教えてください。 よろしくお願いします。

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