BioTechnicalフォーラム [プラスミドを用いたsgRNA/Cas9導入]

プラスミドを用いたsgRNA/Cas9導入

No.6865-TOPIC - 2018/04/23 (月) 08:04:31 - トキマツ

はじめまして、トキマツです。
CRISPR/Cas9法についてご教授ください。

現在、培養神経系細胞にCRISPR/Cas9を用いてノックアウトしたいタンパク質があります。
sgRNAの設計はネット上で行い、TAKARA社のpGuide-it、TransIt-Neuralを使い、プラスミドを導入する形でsgRNA/Cas9を神経細胞に導入しました。

これにはGFP発現配列が含まれており、トランスフェクション後はGFPによる蛍光が確認でき、ひとまず導入はできたと思います。

しかし導入後48時間、Western blottingをしてみると落ちてほしいタンパク質のバンドがしっかり存在しており、Cas9が効いていません。

また、1度トランスフェクションした細胞を4日培養し、その後再びトランスフェクションをして様子を見た細胞でも同じことが起こりました。

どうしてプラスミドが導入されているのにノックアウトされないのか、原因・改善方法を教えていただければ幸いです。
　

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No.6865-11 - 2018/04/24 (火) 10:46:01 - xyz

系が複雑になってしまいますが、Triple-target CRISPR法とか、HITI法でマーカー入れてFACSするとかどうでしょう？

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No.6865-10 - 2018/04/24 (火) 10:31:02 - AA

Neuro2AかPC12あたりかと勝手に思ってましたが、
確かに増殖能がなければクローニングは厳しいですね。
その場合は、線維芽細胞をゲノム編集してそこから分化誘導でしょうか。

(無題)

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No.6865-9 - 2018/04/24 (火) 10:28:02 - み

頻度の低いKO細胞をクローニングするにしても
培養神経系細胞って細胞株（増殖能がある）なのかな？
post-mitoticなら不可能だな。

(無題)

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No.6865-8 - 2018/04/23 (月) 15:42:03 - AA

Cas9を使ったKOの場合、シングルクローンを取って株化することが必須です。
px459をお使いなら、FACSなりで出来ると思います。

Cas9のプラスミドの形質転換効率や、両アリルともに改変が入る確率を考慮すると、
初めのトランスフェクション後のKO株の率は良くてもだいたい5－10％くらいだと思います。

単純なリポフェクタミン導入後にWBをしてもKOは見られないと思います。

(無題)

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No.6865-7 - 2018/04/23 (月) 15:22:16 - シングルにしないと

シングルクローンを拾いましょう。

羊土社の「今すぐ始めるゲノム編集」
px459ベクターを使ったプロトコールが掲載れています。

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No.6865-6 - 2018/04/23 (月) 13:35:22 - ***

両方のアレルに変異が入る確率って結構低い。

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No.6865-5 - 2018/04/23 (月) 13:06:16 - mon

目的タンパクの半減期も考慮する必要があるよ。
正常なmRNAが無くなってもタンパクがなくなるまでのタイムラグが長いものもある。。