平素は勉強させていただいていおります。
この度、細胞膜をビオチン化したライセートから、ビオチン化タンパク質を精製するため、ライセートとストレプトアビジン磁気ビーズとを反応させたいです。
以前、4度で1時間行なったところ、結構な量が上清に残っていました。
この解釈として、
1. ビオチン化タンパク質に対するビーズがそもそも足りていなかった可能性（前回はStreptavidin 200 ug/tubeでプルダウンしました。NEBのビーズ容量でいうと50マイクロL。）、
2. SDSサンプルバッファーで3分煮沸では溶出が不十分である可能性
3. 4度1時間では不十分である可能性、
の3点を考えています。洗浄時に剥がれる可能性はビオチンーストレプトアビジンのKd値から考えると可能性として除外していいのではと考えています。
新しく始めるにあたり、今回以下の点を改善しようと思っています。
1. 今回、ビーズをの量を前回の10倍量使おうと思っています。つまり2 mgのStreptavidinビーズを使用します。
2. SDSサンプルバッファーに2 mM free biotinと10 mM DTTを加え、10分煮沸させます。
3. みなさまに質問したいです。
論文を見ると、ライセートをStreptavidinビーズを4度、一晩だったり、中には室温で1時間などの強者もいるようです（ライセートなのに大丈夫なのでしょうか？）。
できれば4度で短時間で終わらせたいのですが、1時間では不十分でしょうか？
論文を見てはいるんですが、中々探し出せていないです。
かなり昔の論文まで遡って温度と相互作用の関係を調べなくてはなりませんね。
もし皆様の中に経験者がおられれば、教えてくださると助かります。 |
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