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(無題) 削除/引用 No.6875-9 - 2018/05/02 (水) 16:50:10 - yam SYK様 ご指摘ありがとうございます。 一文目に書かれている通りでございます。 核の染まり方はz-stacでも同様の結果でした。 ちなみにDAPIは二次抗体と同時に添加しております。 ターゲットはapical側に局在する膜タンパクです。 文献では、apicalでは細胞全体、middleではハニカム状に、basalでは染まっていないという図が示されております。 先日、positive controlであるHepG2細胞を用いて同様の染色をしたところ文献に類似した染色結果が得られました。しかし、粒のような蛍光がみられ あまり綺麗な画像は取得できませんでした。この粒はCaco-2細胞でも見られました。同時に別のターゲットの一次抗体を用いた際にはこの粒は見られませんでした。

(無題) 削除/引用 No.6875-8 - 2018/05/02 (水) 07:18:51 - SYK PolarizeしたCaco-2のモノレイヤーをメタノール固定し、蛍光染色してconfocalで観察していると理解してよろしいでしょうか？ その場合、「細胞全体と重なるように核が染まり、その上(apical)に重なるように二次抗体が染まっている状況」が、イメージしにくいです。細胞全体がDAPIで染まっているならば、固定法かDAPI染色の問題のような気がします。PFA固定でも全く同じであれば、DAPIの問題かもしれませんが、DAPI染色が問題になる事はあまりないですよね？　ちなみに、細胞全体と重なるようにDAPIが染まっている様子は、z-stackで見ても同様でしょうか？　 その膜タンパクの局在は、apical、basal、lateralサイドのいずれと予想されますか？　もしapicalサイドに局在するタンパクであれば、z-stackで「その上(apical)に重なるように二次抗体が染まっている」というのは、予想される結果と考えることもできるように思いますが、、、

(無題) 削除/引用 No.6875-7 - 2018/05/01 (火) 15:33:26 - yam 皆様 いろいろとご教授してくださり、ありがとうございます。 文献も我々もコンフォーカルで観察しております。 抗体はabcamから購入したモノクローナル抗体でデータシートおよび文献に従い50倍希釈して使用しております。希釈倍率は500倍まで薄めて検討しておりますが、結果は同様でした。 一次抗体を添加せず二次抗体のみを添加しても交差反応は見られずバックグランドのみが見られました。 恥ずかしい話ですが、以前、膜タンパクに関してはメタノールが一般的に使われるという情報を目にしたことがあり、それを鵜呑みにしておりました。固定化には4%PFAも使用しましたが結果は同様でしたが、試薬の選択や時間に関して検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6875-6 - 2018/04/28 (土) 08:03:35 - AP そうですね。核と反応するという問題とは別ですが、膜タンパク質にアルコールは適さないし、界面活性剤も注意が必要です。脂質膜を溶かしてしまい膜タンパク質が流出してしまいます。フォルマリンに安定剤として含まれているメタノールでも影響があると言われています。 膜タンパク質をよく固定する固定液というのもありますが、まずはパラフォルムアルデヒド水溶液かメタノールフリーのフォルマリンで調製した4%フォルムアルデヒドでやるのがいいでしょう。 界面活性剤も濃度を下がるとか、ジギトニン、サポニン、コレートなどを使うとか、工夫する余地があります

(無題) 削除/引用 No.6875-5 - 2018/04/28 (土) 03:21:13 - ｍｍ 細胞膜の蛋白を染めたいのであれば、「浸透処理、0.1%Triton X 100、室温15分」はいらないのではないでしょうか。メタノール、室温15分も強い固定法なので、時間を短くしたり、別な固定法を試してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.6875-4 - 2018/04/28 (土) 02:05:30 - おお お使いの顕微鏡、参考にした文献の顕微鏡はコンフォーカルでしょうか？ 個人的には核膜に細胞表面にあるような膜タンパクがあるというのはあまり違和感がないです（蛋白によるでしょうけど）。

(無題) 削除/引用 No.6875-3 - 2018/04/27 (金) 20:29:01 - ANO 細胞がはがれかかってるときに そういう見え方しますよ

(無題) 削除/引用 No.6875-2 - 2018/04/27 (金) 19:19:18 - AP 抗体に交差反応はつきものです。 核や核小体に交差性をもつ抗体もよくあります。 一次抗体抜きで二次抗体だけのコントロールはありますか。それだとどこも染まらないでしょうか？　だとしたら一次抗体の交差反応の可能性が高くなります。 一次、二次抗体の素性はどんなんですか？ 自作、購入（どこの？）？抗血清？　精製抗体（手法は？）、あるいはモノクローナル？ ポリクローナル抗体に含まれる交差反応性の抗体種は前吸収（pre-absorption)で除くことが出来ます。

蛍光免疫染色、膜タンパクが核と重なって染まる 削除/引用 No.6875-1 - 2018/04/27 (金) 18:32:23 - yam 現在蛍光免疫染色法にてCaco-2生細胞における膜タンパク質の検出を試みています。 各染色はDAPI、標的はマウスモノクローナル抗体、二次抗体はヤギ抗マウス抗体を用いております。 染色の結果、細胞全体と重なるように核が染まり、その上(apical)に重なるように二次抗体が染まっている状況です。参考にした文献とは染まり方が異なり、染まり方も一般的な膜タンパク質とは異なり、どう解釈したらよいかわからない状況です。なにか助言をいただければ幸いです。 染色は以下の手順で行っております。 固定処理、メタノール、室温15分 浸透処理、0.1%Triton X 100、室温15分 ブロッキング、3%BSA、室温60分 一次抗体添加、室温60分 二次抗体添加、室温60分 こういった投稿は不慣れでした、なにか不足事項ありましたら追記いたします。ご協力お願いいたします。

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