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(無題) 削除/引用 No.6889-6 - 2018/05/08 (火) 16:10:30 - おん ＡＰ様、qq様、おお様 返答ありがとうございます。大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.6889-5 - 2018/05/06 (日) 11:10:21 - おお 非蛋白性のPVPで統一するといいかもしれません。BSAよりかなり安いし。Skim milkよりももしかしたらやすいかも。そうするとリン酸化を見るときはどのブロッキング剤でとか使い分ける面倒も省けますし。

(無題) 削除/引用 No.6889-4 - 2018/05/02 (水) 20:14:35 - qq 抗体次第だろうなと思います。 基本的にはわざわざスキムミルクを使う必要はないかもしれないねど、まあBSAよりも安いね。 うまく検出できているのであれば、スキムミルクで悪いとは思いません。 pan-phosphoserine抗体であれば、絶対ダメだろうなとおもいますけど、pp38の抗体は特定のアミノ酸残基のリン酸化を検出する抗体なのでしょ？ だから、スキムミルクごときで反応性を失う抗体だとすると、そのことの方が問題じゃないの？とごねてみるのも良いかもしれない。 上手く検出できているのであれば、スキムミルクやPBSを使うから、特異的なシグナルだけがより強く見えているのかもしれないということです。 、、で、私は何を使っているかというと、PVP25（合成ポリマー）でブロッキングしていて、TBS-Tweenで洗ってますから、説得力はないね。

(無題) 削除/引用 No.6889-2 - 2018/05/02 (水) 19:38:41 - AP リン酸化タンパク質のブロットのブロッキング剤としてはBSAは第一選択といっていいですが、一口にBSAといっても製法、フラクション、純度など様々だから、どれでも同じくらい効きますよとは言いがたい。 ミルクのブロッキング有効成分はカゼインなんですが、カゼインは高度にリン酸化されているのでタンパク質のリン酸化部位を認識する抗体には不適です。PBSもあリン酸を含むからさけろってことでしょうけど、遊離のリン酸はエピトープにはならないはずなので眉唾。気になるならTBSにしたらいいでしょう。大した負担じゃない。 いずれにしろリン酸化タンパク質を検出するけれど、エピトープはリン酸化部位ではないという抗体なら問題ないはずですけどね。

ブロッキング剤および洗浄バッファーの選択 削除/引用 No.6889-1 - 2018/05/02 (水) 19:25:23 - おん 今年度研究室に配属され、ウェスタンブロッティング初心者です。 ウェスタンブロッティングでP-p38およびP-JNKの発現を見ており、研究室のプロトコルではブロッキング剤にスキムミルク、洗浄バッファーにPBS-Twを使用しています。 しかし、ブロッキング剤や洗浄バッファーの選択について調べてみると リン酸化タンパク質をみたい場合にはスキムミルクやPBSをあまり使わない方がいいということが書かれていました。 研究室にはBSAとTBS-Twもあるのですが、P-p38およびP-JNKの発現を見る際にブロッキング剤はBSA、洗浄バッファーはTBS-Twを用いなくてもいいのでしょうか？ 初歩的な質問かもしれませんが、答えていただければ幸いです。 よろしくお願いいたします。

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