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(無題) 削除/引用 No.7502-7 - 2018/12/21 (金) 08:54:47 - AU 過去に上手く行かなかったときは、凍結、パラフィン、固定の仕方等々いろいろ試しましたが、GFP抗体で増感してハレーションするくらい共焦点の感度上げればなんとかでしたが、Figureにするには耐えられない出来で、つけたGFPタグをin-situするという本末転倒なことになってしまいました。 （そもそも、発現低いだけといのもありますが、それもあってのタグ付けでして…） 多重染色用にGFPタグつけて、GFP抗体＋他抗体で多重染色したいという目的です。 別のマウスにて、凍結でのGFノックインタグ観察や、GFP抗体の免染等はルーチンで行っているので、標本作成や染色法等には問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.7502-6 - 2018/12/21 (金) 08:51:04 - TK-1 >[Re:4] おおさんは書きました : > GFPは固定するとかなり蛍光が弱くなるみたいですが、そういうことではないですか？ membrane-boundにすると結構いけます。

(無題) 削除/引用 No.7502-5 - 2018/12/21 (金) 07:33:59 - レンチン GFPは抗体で感度を上げることができますよ。

(無題) 削除/引用 No.7502-4 - 2018/12/21 (金) 05:49:06 - おお GFPは固定するとかなり蛍光が弱くなるみたいですが、そういうことではないですか？

(無題) 削除/引用 No.7502-3 - 2018/12/21 (金) 05:23:51 - AU 目的は、免疫染色が難しく、gfpタグで発現細胞を可視化するです。 In-situは可能ですが、多重染色用です。 In-situの結果となるべく一致していることが、望ましいです。 KI部位により、タグの発現パターンが変化することがあるのは、承知なのですが、今回、複数パターンのマウスを作成するほど、予算がありません。 5’末にGFP-2a-Cre-stopをKIして、Creは機能しても、GFPほとんど機能しなかった経験と、3’UTRでのIRES-GFPが同じく機能しなかったことがあり、3’末-2a-GFPの経験はないですが、どうかと思っています。 5’末gfpもIRESも、うまく行ったこともあるのですが、経験豊富な方か入ればお聞かせ頂ければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.7502-2 - 2018/12/21 (金) 04:38:38 - おお >対象が分泌タンパクで、3’末に-2a-GFPで、つけるか、 >FirstATGに合わせて、GFP-stop入れて、KI-KO形式にするか迷い中です。 まようって、それぞれの実験でうまく行っても違う結果になりそうな気がします。目的はなんですか？

分泌たんぱく遺伝子へのGFPtagノックインマウス 削除/引用 No.7502-1 - 2018/12/20 (木) 18:45:26 - AU GFPタグ、KIマウスを作成する予定なのですが、 対象が分泌タンパクで、3’末に-2a-GFPで、つけるか、 FirstATGに合わせて、GFP-stop入れて、KI-KO形式にするか迷い中です。 KOマウスは、耐性致死ですがヘテロの表現型は、はっきりしません。 KOが耐性致死で、別途Floxマウスを持っていることから、KOマウスを新たに得るメリットは少ないのですが、分泌タンパクの3’で2a-GFPが、機能するか不安で、経験ある方いれば、ご意見頂ければ幸いです。 強制発現細胞株の3’に2a-GFPをつけた際に蛍光が弱く不安が増しています。

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