BioTechnicalフォーラム [T7 RNA polymeraseの異種発現]

T7 RNA polymeraseの異種発現

No.7641-TOPIC - 2019/02/01 (金) 14:06:50 - アル

BL21は形質転換効率が低いですし、BL２１以外の大腸菌例えばDH5等にT7ポリメラーゼを異種発現させたエレクトロ用のコンピを造りたいと考えております。具体的にはBL21のゲノムを鋳型に、lac UV5プロモーターを含めてT7 RNAポリメラーゼをクローニングします。正直、このようなことをしたと言う報告を聞いたことがないのですが、何か問題があるのでしょうか。
　

- このトピックにメッセージを投稿する -

全8件 ( 1 ～ 8 )　前 | 次　1/ 1. /1

ありがとうございました

削除/引用

No.7641-8 - 2019/02/01 (金) 20:11:03 - アル

AP様、おお様、moz様、教えていただきありがとうございました。やはりひと手間を惜しまずきちんとクローニングするのが一番安全かもしれません。DH5以外のK12で発現宿主を探すのは気がつきませんでした、またBL２１株でも効率のよい株が商品化されていることは知りませんでした、参考にさせていただきます。色々教えていただきありがとうございました。

(無題)

削除/引用

No.7641-7 - 2019/02/01 (金) 18:06:29 - AP

発現用宿主に形質転換効率を求めるのはあまり意味がないと思う。
ライブラリをぶち込んで発現スクリー二ングでもしようってのなら別だけど。

ベクターのコンストラクションの段階でligation産物をいきなりBL21に入れて組換え体をスクリーニングしているのかしら。
普通はコンストラクションの段階ではクローニングに適した宿主JM, XL, DHシリーズなんかでやって、クローニングされたプラスミドを発現宿主に導入するもんじゃないかい？

そこんところどういう戦略なんでしょうか？

発現用宿主はクローニングには不向きなところがいくつもあって、
・DNA組換え系の変異を持たないので、プラスミドが組換えを起こしてしまい,
インタクトなコンストラクトが取れなかったり、安定に維持できないかもしれない。
・発現用宿主なだけに誘導をかけなくても漏れ発現が起こる。それが大腸菌に毒性を示すと、そもそもコロニーが生えなかったり、生えても増やせなかったりする。
・形質転換効率が大概低め。
なのでプライマリークローニングには使わないもんだ。

(無題)

削除/引用

No.7641-6 - 2019/02/01 (金) 16:59:33 - moz

BL21派生株で形質転換効率がよいものも販売されているよ。
www.nebj.jp/products/detail/95

(無題)

削除/引用

No.7641-5 - 2019/02/01 (金) 15:25:14 - おお

異種発現っていうかな？

(無題)

削除/引用

No.7641-4 - 2019/02/01 (金) 15:23:55 - おお

http://www.emdmillipore.com/US/en/product/HMS174DE3-Competent-Cells-Novagen,EMD_BIO-69453

DH5と同じK12に属する大腸菌でT7RNApolが発現する菌は作られて売られているようですが。