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ウェスタン：サンプル間の発現量が大きく異なる場合 トピック削除
No.7996-TOPIC - 2019/06/18 (火) 17:28:53 - 麦
いつも勉強させていただいております。

マウス肝サンプルの標的タンパク質発現量をウェスタンブロットにてコントロール群・処置群間で比較したく実験しております。
処置群では良好なバンドを検出できていますが、コントロール群での発現量がとても低く、20 µg/wellのインジェクション、PierceのノーマルグレードHRP試薬でほぼバンドが見えません。

このようにサンプル間でターゲットの発現量が大きく異なる場合、どのように比較したらよいでしょうか。
高感度の試薬を用いる場合、高発現量側でサチュレーションする恐れがあるので、例えば低発現量サンプルのみタンパク量を増やす、あるいは高感度の検出試薬を用いるといった手法は本データを学術論文にする上で許容されるのでしょうか？
サンプル間の比較はハウスキーピングタンパクとの相対値で行う見込みです。

以上、何卒ご査収の程お願い申し上げます。
　
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(無題) 削除/引用
No.7996-6 - 2019/06/19 (水) 22:14:30 - おお
>バントとして認識できる程度のシグナルが出ていて、強いバンドのほうが飽和する前のイメージでも定量は出来なくもない。

一つ追加しておくと弱いほうはノイズの影響が出やすくなるのでRatioを計算するとSDが大きくなる傾向にあるでしょう。

３回やるとして、同時にながして両方のシグナルの平均値が出せるならましになるかもしれない。

(無題) 解決済み 削除/引用
No.7996-5 - 2019/06/19 (水) 13:23:56 - 麦
AP様、おお様

ご丁寧な回答ありがとうございます。
今回の場合仰せの通りそこまで厳密な定量性は求められない実験系だと思うので、露光時間の調整等で多い側が飽和しない程度のレンジでの比較で対処しようと思います。

※サンプルインジェクションは直前まで質量分析計の作業をしておりその用語に引っ張られてました

(無題) 削除/引用
No.7996-4 - 2019/06/19 (水) 03:31:59 - おお
そうそう、加えますがこの手の定量は３回やって３回とも同じことが言えているかを示す方法論としてやっていることもあります。なので定量せずとも３回のデーターをすべて示すとか、一つを論文の本文用の図にして、のこりをSIに出しておくとか色々やりようがあると思います。

(無題) 削除/引用
No.7996-3 - 2019/06/18 (火) 21:11:05 - おお
まず正確な定量が必要なのか。

カメラで撮っているならそのダイナミックレンジを見てみるといい。
見た目ほとんどバンドがなくても、バントとして認識できる程度のシグナルが出ていて、強いバンドのほうが飽和する前のイメージでも定量は出来なくもない。

また、強いほうのサンプルを段階希釈していってどの程度差があるか見積もる事も可能。

ハウスキーピングタンパクがほぼそろっているなら片方が飽和していていてもそのまま計算して半定量的ということで数値化する。

まあ定量が必要ない明らかなばあいも定量を要求したりする人もいるでしょうけど、困ったもんだといえばそうでしょう。

(無題) 削除/引用
No.7996-2 - 2019/06/18 (火) 18:49:57 - AP
いずれにしてもサンプルごとに異なる処理をしているのであれば比較はできないでしょう。

同じブロットでlong exposureとshort exposureを撮り、両方載せる。
これは昔から論文でよく見る方法。多い、少ない、とっても多い程度の半定量的なことをいうだけならそれで十分でしょう。

強度が大きく違うとき、どれくらい多いのか少ないのかをもっと定量的にいうのなら、それぞれのサンプルを希釈列としてウェルにアプライして、あるいはドットブロットして、比較したい物同士で、どの希釈とどの希釈で強度が釣り合うかをみるみたいなことしなきゃならないでしょう。

ところでサンプルをゲルのウェルに入れることをインジェクションいいますか。　ラボの伝統というか方言みたいなもんですかね。

ウェスタン：サンプル間の発現量が大きく異なる場合 削除/引用
No.7996-1 - 2019/06/18 (火) 17:28:53 - 麦
いつも勉強させていただいております。

マウス肝サンプルの標的タンパク質発現量をウェスタンブロットにてコントロール群・処置群間で比較したく実験しております。
処置群では良好なバンドを検出できていますが、コントロール群での発現量がとても低く、20 µg/wellのインジェクション、PierceのノーマルグレードHRP試薬でほぼバンドが見えません。

このようにサンプル間でターゲットの発現量が大きく異なる場合、どのように比較したらよいでしょうか。
高感度の試薬を用いる場合、高発現量側でサチュレーションする恐れがあるので、例えば低発現量サンプルのみタンパク量を増やす、あるいは高感度の検出試薬を用いるといった手法は本データを学術論文にする上で許容されるのでしょうか？
サンプル間の比較はハウスキーピングタンパクとの相対値で行う見込みです。

以上、何卒ご査収の程お願い申し上げます。
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