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(無題) 削除/引用 No.8000-11 - 2019/06/22 (土) 11:45:23 - み > 可能性として2つあります。 > > 1. 溶出されずにビーズ上に残っている > > 2. アミコンで濃縮した際にフィルターに詰まってロスしている？ > > 実はアミコンした際に5分で500ulしかパススルーしないなど、かなり詰まっている印象でした。 > これが原因でしょうか？ > ビーズの一部をサンプルバッファーでボイルして流したらいいじゃん。 5分で500ulていわれても蛋白含んでたら別に普通じゃないって思うけど、ロスしてる可能性も否定できない。アミコン素通りしてる量もまあまああるかもだし、フィルターに吸着してるかもだし。フィルターもサンプルバッファーで洗って流したらよい。 全て自分で確認作業してもらわないと何も見えてこない。

(無題) 削除/引用 No.8000-10 - 2019/06/22 (土) 09:46:25 - とも おおさん 培養上清の3回分のフロースルー画分を同じようにゲルに流し、ウエスタンをしたところ、プルダウン前のバンドが3回目のフロースルー画分で全てなくなりました。 ただ、500mMイミダゾールで溶出したものを濃縮、バッファー交換して得られたものを見ると圧倒的に溶出画分に少ないんです。 可能性として2つあります。 1. 溶出されずにビーズ上に残っている 2. アミコンで濃縮した際にフィルターに詰まってロスしている？ 実はアミコンした際に5分で500ulしかパススルーしないなど、かなり詰まっている印象でした。 これが原因でしょうか？ おおさん、お願いします。

(無題) 削除/引用 No.8000-9 - 2019/06/22 (土) 08:16:57 - おお おかしいかも判断が付きませんよ。 もともとどれくらい発現があったのか？収量が少なくても収率はいいのかもしれないし。抽出の効率もわかりませんし。 GFPがLysateをながしてCBBでメジャーなバンドとして見れるならといったのは、実際にあなたのタンパク質でそれぐらい発現するか確かめてみたら？ということでたくさんの蛋白がそのようにはうまく発現しないからであって、上手くいくと思う前に確認することがあるはずです。

(無題) 削除/引用 No.8000-8 - 2019/06/22 (土) 02:20:14 - とも 10cmディッシュ12枚から精製を試みましたが、全く採れませんでした。 コス7細胞にトランスフェクション後、3日目の細胞をトリプシンで剥がし、中和、遠心したペレットをPBSで2度洗浄し、大きなペレットに7mlの1x 細胞溶解バッファーを加えました。 組成は、 1％トリトンX100 PBS +プロテアーゼインヒビターカクテル（EDTAフリーを確認済み） です。 氷上15分静置ののち、遠心（5000g 5分）した上清に、PBS-Tで平衡化したニッケルビーズを500μl加え、カラム内で90分、4度でバッチ法で結合反応ののち、未結合分画を排出後、PBS+少量のイミダゾール（7.5mMと20mM）で2カラムボリューム（CV）ずつ洗い、最後に500mMイミダゾール5CVで溶出を試みました。 この結合、溶出を3回繰り返し、合計15mlの溶出液を30kD カットオフのアミコンカラムで濃縮、バッファー置換を行いました。 300μlまで濃縮後、その1/30である10μlをSDS-PAGEしてみました。 結果、全くバンドが見えずでした...。 今その膜をウエスタンで見ようとしていますが、ダメな気がします。 この方法ではよくないのでしょうか？ 本当はFc融合タンパク質として発現精製させたかったのですが、収量が悪く、ヒスタグの系に移行させたのですが...当方、ヒスタグタンパク質の精製にいい経験がありません。何かがおかしいのでしょうか？ ビーズ、イミダゾールはいずれも消費期限いないのものを使用しています。

(無題) 削除/引用 No.8000-7 - 2019/06/19 (水) 14:03:59 - とも おおさん、 そうなのですね！ protease inhibitorはEDTAが含まれてるのを使わないようにします おおさんは結合反応の時間をどれくらいで行いますか？ 私はおそらく5 mlほどのライセートを調製すると思います。 バッチ法かプラスチックの容器にビーズを充填したオープンカラムに何度か通すかで思案しています。 おおさんのご経験から、まずはこれを試してはどうか、というデフォルトのプロトコルはございますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8000-6 - 2019/06/19 (水) 14:00:36 - とも みさん ありがとうございます。 おっしゃる通りです。

(無題) 削除/引用 No.8000-5 - 2019/06/19 (水) 13:57:41 - とも TSさま　 はい、結合反応に10 mM Imidazoleを加え、洗浄は25 mM imidazoleで行い、溶出を300 mM imidazoleで行う予定です。

(無題) 削除/引用 No.8000-4 - 2019/06/19 (水) 13:34:26 - おお ＞ライセートから精製される組換えタンパク質の収量はいかほどでしょうか？ どれぐらい発現してくれるかによります。GFPとかだとCBBで他のバンドより多い状況で見えるほど発現してくれるので100マイクログラムとるにはそんなリ労力はかからないと思います

(無題) 削除/引用 No.8000-3 - 2019/06/19 (水) 13:14:57 - み >[Re:1] ともさんは書きました : > 3点質問させてください。 > 1. 1時間、4度での結合反応は身近いでしょうか？タンパク質分解酵素阻害剤を加えているので、一時間室温での結合反応の方が良いのか、それとも例えば6時間、4度での結合反応を試した方がいいでしょうか？ プロテアーゼ阻害剤なんて完璧ではなくおまじない程度と考えておいた方が良い。室温より4℃の方が蛋白にとっては良いでしょう。 > > 2. ニッケルビーズへの非特異的結合を抑えるため、10mMイミダゾールを加えていますが、高すぎでしょうか？5mMでも非特異的結合は抑えられますでしょうか？ それはあなたが条件検討すべき項目でしょう。あなたの実験系、標的蛋白のS/N比は他の人にはなんとも分らん。 > 3. 細胞溶解バッファーとしてもう少し適切なものはありますでしょうか？ あなたの標的蛋白に関してHEK293からの抽出効率・カラムへの結合・非特異蛋白のノイズなど加味して最適な条件を検討されるべき。

(無題) 削除/引用 No.8000-2 - 2019/06/19 (水) 12:54:17 - TS ＞この時、10mMイミダゾールを加えています。 この作業は結合反応、洗浄後の溶出で正しいですか。

ライセートからヒスタグタンパク質の精製 削除/引用 No.8000-1 - 2019/06/19 (水) 12:15:44 - とも いつも勉強させてもらっています。 ここのフォーラムの過去トピックを参考にして、293T細胞で細胞質タンパク質を作製することにしました。 6ウェルに撒いた細胞にトランスフェクションし、その2日後の細胞をPBSで2度洗い、1xPBSに1％トリトンX100+タンパク質分解酵素阻害剤を加えて細胞のライセートを調製しました。 氷上20分後、遠心した上清に、平衡化したニッケルビーズを加え、1時間4度でローテーションしました。 この時、10mMイミダゾールを加えています。 その後、インプット、非結合分画、溶出分画を取りウエスタンを行ったところ、濃縮できてはいました。 ただ非結合分画にも多少のこっていました。 今、スケールを上げ、100mmディッシュ3枚に撒いた細胞から明後日、精製に取り掛かります。 3点質問させてください。 1. 1時間、4度での結合反応は身近いでしょうか？タンパク質分解酵素阻害剤を加えているので、一時間室温での結合反応の方が良いのか、それとも例えば6時間、4度での結合反応を試した方がいいでしょうか？ 2. ニッケルビーズへの非特異的結合を抑えるため、10mMイミダゾールを加えていますが、高すぎでしょうか？5mMでも非特異的結合は抑えられますでしょうか？ 3. 細胞溶解バッファーとしてもう少し適切なものはありますでしょうか？ 4. もちろんタンパク質にもよるとは思いますが、ライセートから精製される組換えタンパク質の収量はいかほどでしょうか？100マイクログラムほど精製できるものでしょうか？私は分泌タンパク質を長く作製してきていますが、同じようにコス7で10cmディッシュ10枚の培養上清からだと500から1000マイクログラムは精製できています。 ライセートからの精製はほぼ初めてですので、非常に不安です。 どれほど精製できるのかとても気掛かりです。うまくいくでしょうか...？

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