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(無題) 削除/引用 No.8019-15 - 2019/06/25 (火) 09:01:50 - 独り言 抗体希釈液にcan get signal もしくはその類似品を使用するのに一票。 試供品とかもらえると思うので、試してみては。

(無題) 削除/引用 No.8019-14 - 2019/06/25 (火) 07:14:43 - こんにゃく 情報小出しにしてしまいすいません。 皆様のご助言感謝いたします。 露光時間は1時間にしてみます。 また、撮影方法なやスキムミルクの濃度などもう1度検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.8019-13 - 2019/06/25 (火) 03:38:08 - おお もし一次抗体処理をを室温などで数時間でやっているなら、４度オーバーナイトでやればシグナルが強くなることは多いです（ただバックグランドも高くなる傾向もある）。

(無題) 削除/引用 No.8019-12 - 2019/06/25 (火) 03:31:25 - mom 情報が小出しされてイライラしますが。 ブロッキング剤が5％スキムミルクというのもオーバーブロッキングになることも有ります。0.5%や1％が良いときもあります。 m-hub.jp/biology/2120/131 www.atto.co.jp/site/content/download/2447/26026/file/Tips+for+WB.pdf また、一次・二次抗体希釈に5％ブロッキング剤を使うのもシグナルが弱くなる原因です。ブロッキング剤を1/00-1/20にPBS-T等で希釈したものをお薦めします。

(無題) 削除/引用 No.8019-11 - 2019/06/25 (火) 02:53:38 - おお ＞２倍縮めると なんか表現が変ですね。二分の一に縮めるとと書くべきでした。

(無題) 削除/引用 No.8019-10 - 2019/06/25 (火) 02:29:12 - おお >ローディングコントロールは20秒ほどで出ておりましたが、 アクチンとかGAPDHなら（もちろんいろいろなパラメーターがありその違いで検出感度も変わってきますが）、２０秒かかるのは長いなという感触はあります。 例えばカメラとMembraneの距離を２倍縮めると４倍感度が上がります。なので私はImagerの台を置くところを無視して、発泡スチロールなどを積み上げてこれ以上上げるとフォーカスが合わなくなる直前まで上げてカメラで撮ってます。プラクティカルのどれくらい良くなるかはしっかりした確認をしているわけではないですが、興味があれば一度やってみてはどうでしょうか・ ＞Can get signal Can get signalと相性が悪い抗体もあるという話を聞いたことがあるような気がします。シグナルが弱いなら従来のBufferでやってみるのも手かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8019-9 - 2019/06/25 (火) 00:54:19 - おお >ターゲットは20分でようやく薄くでました。 露光時間はどれくらいまで伸ばせますか？一時間以上行けるならなんとかデーターにできるほどになりませんでしょうか？ また高感度ECLに関しましては近年どんどん感度が上がっています。GE等の商品でもECL plus以上のものが２つほど出ていたかと思いますが、もし良さげなものが見つかるならサンプルなど交渉してみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8019-8 - 2019/06/25 (火) 00:26:36 - こんにゃく 皆さまご回答ありがとうございます。大変参考になります。検出はカメラです。Ripaバッファーにプロテアーゼ阻害剤カクテルをいれてサンプルを回収してます。ブロッキングは5％スキムミルクで、1次抗体にはCan get signalを使用し、1：500で使用しました。1次抗体のデータシートでは1：1000〜3000でした。2次抗体はスキムミルク1：5000で行っております。今のところバックグラウンドは出ておらず、ローディングコントロールは20秒ほどで出ておりましたが、ターゲットは20分でようやく薄くでました。ゲルは購入しております。

(無題) 削除/引用 No.8019-7 - 2019/06/25 (火) 00:07:07 - おお >ゲルは自作ですか？どのバッファーシステムですか？ 分解能を上げるという点でいくらかテクニカルなこともありますから。。。

(無題) 削除/引用 No.8019-6 - 2019/06/24 (月) 22:53:22 - おお 検出はフィルムでやってますか？それともカメラですか？ もしカメラでやっているなら事情が許せるならその蛋白に関してはフィルムでやってみてもいいかもしれません。フィルムで弱いなら、バックグランドを抑えるために念入りにWashしてからフィルムにコンタクトするのをOver nightにしてみてもいいかもしれません。ただ定量という意味ではすこしコントロールするのが難しいかもしれません。 タンパク量を多くするのはみなさんと同意見で多くすればいいというわけでもないです。場合によっては少ないほうが分解能をDisturbする要因が少なくなってうまくいくこともありますから。 ゲルは自作ですか？どのバッファーシステムですか？

(無題) 削除/引用 No.8019-5 - 2019/06/24 (月) 19:30:56 - mom 一次抗体・二次抗体の使用濃度が不明ですが、抗体濃度を上げると良いときもありますが、バックグランドが上がる可能性もあります。 CanGetSignal等の増感剤を使うのも抗体濃度を上げるのと同等の効果があります。

(無題) 削除/引用 No.8019-4 - 2019/06/23 (日) 21:17:42 - こんにゃく ありがとうございます。詳細記載せず失礼しました。現在、高感度の化学発光試薬を使用しております。では1次抗体の濃度をあげてみるというのはいかがでしょうか？増幅系(ABCとかTSAなど)は検討させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.8019-3 - 2019/06/23 (日) 18:03:37 - AP あんまりロード量が多いと分離が悪くなる。 第一、20 ugを30 ugにしたところで大差ないでしょう。普段2 ugでやっているところ10 ugとか20 ugにするってんならともかく。 ひとつの解決策としては、必要な画分を取って濃縮したものを使う。 核タンパク質なら核、膜タンパク質なら膜というように分画、あるい濃縮する。 内部標準にはそれぞれの構造に既知のタンパク質を検出する。 薄いけどバンドは検出できているなら、高感度系の検出試薬を使うとか増幅系(ABCとかTSAなど)を使うのもいい。

(無題) 削除/引用 No.8019-2 - 2019/06/23 (日) 18:03:36 - mom たかだかタンパク量を1.5倍に増やすより、より感度の良い（発光）試薬を使用すればよいと思います。簡単に感度が5~10倍になりますよ。 タンパク量を増やし過ぎると、WBメンブレンの結合容量を超えるバンドが出たりしますので注意してください。

ウエスタンブロッティングのたんぱく質量について 削除/引用 No.8019-1 - 2019/06/23 (日) 16:55:45 - こんにゃく お世話になります。ウエスタンブロッティングのバンドが薄いためたんぱく質量を増やそうと考えております。ある文献で10〜20マイクログラムが妥当と書いており、電気泳動に20マイクログラムでサンプル液量を調整しましたがバンドが薄く、次回30マイクログラムに調整しようと考えております。皆さまはいつもどのくらいの量で調整してますでしょうか？

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