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PCRサンプルのバンドパターンがおかしい トピック削除
No.8180-TOPIC - 2019/08/21 (水) 12:40:11 - PCRうまくいかないマン
画像の添付ができず説明がしにくいですが、genotypeサンプルのPCR後の泳動バンドパターンが三角形になっておりgenotypeの判断がつかない状況です。

組成は２% アガロースでマーカーのバンドパターンは問題なく見えています。
PCRをかける際のDNA濃度は50ng程度でExtaqを用いています。
またgenotype用のDNA抽出は耳片に50mM NaOHを添加し 95℃ 30分処理し 1M Tris (pH8)にて中和しています。

以前からgenotype PCRを行っていますが上記のようなバンドパターンは初めてで解決策が見いだせず困惑しております。

ご教示のほどよろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.8180-8 - 2019/08/22 (木) 16:37:40 - PCRうまくいかないマン

たろうさん

コメントありがとうございます。
一様に溶解できていないゲルというより、どうやらTAEが原因だったようです。
（均一に全サンプル（マーカー以外）がきれいな三角形の形状のバンドが見受けられたので）
古い50 XTAE ストックだったせいでイオン組成が変わったのかわかりませんが...

ともかく、解決したのでよかったです。
貴重なご意見ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.8180-7 - 2019/08/22 (木) 09:13:30 - たろう
ゲルの溶解が不十分であったり埃等の異物が混入すると一様でないゲルができることがあります。
部分的に出来た不均一なところとバンドやレーンが重なると泳動が乱れ、変な形のバンドができます。
綺麗な三角形のバンドを見たことはありませんが、レーンの左半分しかない変な形のバンドは見たことがあります。

新たなゲルで良好な結果を得たということ、よかったですね。

(無題) 解決済み 削除/引用
No.8180-6 - 2019/08/21 (水) 18:23:50 - PCRうまくいかないマン
皆様貴重なご意見ありがとうございました。

バンドは形状が三角形でした。
わたしもそんなバンド見たこともなかったので、もしそのようなバンドを見たことがある方がいらっしゃればご意見をいただきたかった次第であります。

おおさんがご指摘の点はすでに検討しておりました。言葉足らずで申し訳ありません。

そこで、たろうさんがご指摘のように私どももゲルを疑いTAEを作成し直し新たなゲルで泳動した結果、みなさんがよく認識されているであろうゲルコームで作成したウェルと同様の形状であるバンドを得ることができました。

ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.8180-4 - 2019/08/21 (水) 16:24:31 - おお
以前からやっていたというけど、同じプライマーを使って今回へんだったということか？

昔使ったサンプルは今の状況でちゃんと流れるか？なにか前と違った事をしてないか？

解決策が見出せないという事はいくらか試行錯誤したように聞こえるが何をやったのか？周りのヒトの意見は？

グーぐるでdna electrophoresis troubleshootingで画像検索すると解決しちゃうかもよ。

原因はゲルではなかろうか 削除/引用
No.8180-3 - 2019/08/21 (水) 15:50:27 - たろう
マーカーを流したレーンは問題なくても他のレーンが駄目ということはあって、ゲルに問題があったのではないかという気がします。

それはそうとして、状況がよりよく伝わるように再説明されるとよいと思います。

(無題) 削除/引用
No.8180-2 - 2019/08/21 (水) 15:07:23 - AP
>画像の添付ができず説明がしにくいですが、genotypeサンプルのPCR後の泳動バンドパターンが三角形になっておりgenotypeの判断がつかない状況です。

どう状況なのかさっぱりわかりません。
バンドの形状なんかが三角形じゃなくて、バンドパターン（一般的にはバンドの本数や位置の型を指すと思うが）が三角形なんですか？　想像もできないや。

論文書くときでも、写真を見ろだけじゃダメで、写真に見えることを言葉、文章で、それだけで成立するくらいの説明描写しなきゃならないものでしょ。頑張って説明してみてよ。

PCRサンプルのバンドパターンがおかしい 削除/引用
No.8180-1 - 2019/08/21 (水) 12:40:11 - PCRうまくいかないマン
画像の添付ができず説明がしにくいですが、genotypeサンプルのPCR後の泳動バンドパターンが三角形になっておりgenotypeの判断がつかない状況です。

組成は２% アガロースでマーカーのバンドパターンは問題なく見えています。
PCRをかける際のDNA濃度は50ng程度でExtaqを用いています。
またgenotype用のDNA抽出は耳片に50mM NaOHを添加し 95℃ 30分処理し 1M Tris (pH8)にて中和しています。

以前からgenotype PCRを行っていますが上記のようなバンドパターンは初めてで解決策が見いだせず困惑しております。

ご教示のほどよろしくお願いいたします。
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