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(無題) 削除/引用 No.8182-8 - 2019/08/23 (金) 13:18:23 - ｈ 同じサンプルをTriplicateして揃わないのなら手技の問題だし、 違うサンプルで揃わないのならRTのRNA量が違っていたとか。 あとはβアクチンがふさわしくないか。

(無題) 削除/引用 No.8182-7 - 2019/08/23 (金) 10:52:24 - AP サンプル間で揃わないのか、同サンプルでブレるのか？ サンプル間で揃わないのは原理的にある程度しょうがない。 サンプルごとにRNA抽出効率や純度が違うし、定量で揃えても定量は用意に干渉を受けるので過信できない、逆転写効率はサンプルごとに異なる、、、、、、 そういうサンプルごとのブレは排除できないから、内部標準で標準化するんだろ。 もっともあまりにも大きくブレる場合は、なにかしら手技的なエラーが起こっていると疑われるし、線形性が失われて内部標準が標準にならないようなレベルでずれている可能性もあるので、よろしくないけれど。 ちなみに、RTマイナスではちゃんと陰性になりますか（ゲノムDNAの混入による干渉はないか？）。 PCR産物を電気泳動で定性的に評価したことは（強度のブレは実は異なる増幅産物に起因している可能性はないか）？ まあ、同僚は問題なくできているんだし、結局「手の問題」に尽きると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.8182-6 - 2019/08/23 (金) 01:18:44 - おお もし同じcDNAを使って同じような結果なのであればqPCRの腕は確かと言えるが、何が問題かはかんたんに絞り込めるんじゃないか？ ＞同じ細胞でqPCRをかけた先輩のβアクチンは揃っていた あなたのcDNAか？ βアクチンで補正したターゲットの量（dCTなど）は各サンプルで揃っているか？ すこしは頭を使ってほしいです。

(無題) 削除/引用 No.8182-5 - 2019/08/22 (木) 20:41:09 - 研究室1年目の素人 βアクチンに関しては2群をそれぞれn＝3でみています。(つまり検討しているβアクチンのCq値は6つあります) ずれるときの例としては、5つのβアクチンのCq値は0.5程度で揃っていますが、1つだけ他とは1.5〜2も離れる感じです。 同じ細胞でqPCRをかけた先輩のβアクチンは揃っていたのでプライマーは大丈夫そうです…

(無題) 削除/引用 No.8182-4 - 2019/08/22 (木) 20:34:34 - 研究室1年目の素人 返信ありがとうございます、βアクチンの発現量を見ているのは同じ細胞です。 qPCRでは、前立腺がん細胞+PGE2と前立腺がん+エタノール(こちらがコントロール) の条件で検討しており、その際にβアクチンをコントロール遺伝子として使っている状況です。

(無題) 削除/引用 No.8182-3 - 2019/08/22 (木) 20:03:00 - おお βアクチンで補正して結果を出すのだからその結果がどれくらいぶれるかで評価するべきではないでしょうか。 βアクチンは実際どれくらいぶれるのですか？またβアクチン自身が動いている可能性も視野に入れるべきではないか。 βアクチンだけ結果が安定しないというなら、プライマーを変えるなりの対処方法も必要ではないか。

(無題) 削除/引用 No.8182-2 - 2019/08/22 (木) 18:57:47 - AP >しかし、何度やってもβアクチンのCq値が揃わず解析が出来ない状態が1ヶ月以上続いています。 なにとなにの間で揃わないと言っているのか？

qPCRをかけた時にβアクチンが揃わない 削除/引用 No.8182-1 - 2019/08/22 (木) 18:31:53 - 研究室1年目の素人 研究室に所属して半年程度のB4です。 最近目的遺伝子の発現を見る際に、housekeeping遺伝子としてβアクチンをqPCRしています。 がん細胞にPGE2 添加し、isogenによるRNA抽出・クロロホルム/イソプロパノールによるRNA回収・super script�Aを使ったRT・SYBRを用いたqPCRという流れです。 しかし、何度やってもβアクチンのCq値が揃わず解析が出来ない状態が1ヶ月以上続いています。他の研究室の人では問題なくqPCR出来ているのでプライマーのせいではないだろうし、アクチン以外の他の遺伝子は揃う事もあるためcDNAにも問題がなさそうです。 知識が豊富な方にトラブルシューティングして頂けると助かります…

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