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(無題) 削除/引用 No.8294-10 - 2019/10/06 (日) 22:33:14 - つ ああ、培地じゃないですね。 すみません。ブロッキングを10%FBSでやるから、その溶液中で抗体反応させるということでしょうか

(無題) 削除/引用 No.8294-9 - 2019/10/06 (日) 22:31:48 - つ なんか意地悪な人いるなあ。 剥がす時は5mMEDTAでやりました。 抗体反応のときに培地を入れる理由はあるのでしょうか？ PBSに細胞を入れておいてそこに抗体が1/100になるように反応させるのでは？

(無題) 削除/引用 No.8294-8 - 2019/10/06 (日) 14:59:49 - っていうか 人に聞く前にまずは自分で検索したら？標準的なプロトコールなんていくらでも出てくるでしょうに。何やってんの？

(無題) 削除/引用 No.8294-7 - 2019/10/05 (土) 23:55:27 - ******* Cell dissociation buffer enzyme freeで検索してみて下さい。

(無題) 削除/引用 No.8294-6 - 2019/10/05 (土) 19:18:31 - FACS 皆様アドバイスいただきましてありがとうございます。 初めて行うので、トリプシン処理して検出出来ないと困るので、5mM EDTAで細胞を剥がそうと思います。その際は5mM EDTA in PBS出良いのでしょうか？ 剥がして遠心して、再懸濁、抗体反応する時は5mM EDTA, 10%FBS? in PBS出良いのでしょうか？FBSよりBSAの方が良いのであればその濃度も教えていただけると助かります。

(無題) 削除/引用 No.8294-5 - 2019/10/05 (土) 19:07:39 - つ 5mMEDTAだと検出できてトリプシンだとできない膜タンパクがありました。

(無題) 削除/引用 No.8294-4 - 2019/10/05 (土) 08:36:08 - M 細胞表面のインテグリンをFACSで検出する場合、トリプシンは使わない方が無難と思いますが、やってみないと分からない部分もありますね。5mM程度のEDTAとトリプシンの比較をしてみてはどうでしょう？ 細胞の種類によっては、バッファーにFBSを入れた方が良いかもしれません（必ず必要という訳ではないですが）。細胞内タンパクの染色をしたい場合は固定透過処理が必要ですが、細胞表面だけなら不要です。 二次抗体を使う場合、蛍光標識されていない一次抗体と、直接蛍光標識されている他の抗体の動物種がかぶらないよう、気をつけて下さい。例えば、標識していないマウスCD44抗体を、蛍光標識した抗マウス二次抗体で検出するとして、インテグリンB4の抗体が直接標識されたマウス抗体だと、二次抗体はインテグリン抗体にも結合してしまいます。

(無題) 削除/引用 No.8294-3 - 2019/10/04 (金) 05:48:23 - おお >上清を除いたのち再懸濁して抗体反応を行おうと考えていますが、 https://www.abcam.com/protocols/direct-flow-cytometry-protocol 基本的なプロトコールを見た上での質問でしょうか？ちゃんとしたプロトコールをまだ読んでなければ探してみてください。

(無題) 削除/引用 No.8294-2 - 2019/10/04 (金) 05:39:36 - 遠さく爆推し 私ならまずは普通にトリプシンで剥がして、それで染めてみますね。 よく使われていて特異性が担保されてる抗体なら、ネガコンを用意して必ず細胞を用意して、トリプシン処理でも検出できたら、大丈夫だろうと私なら先に進めます。 非トリプシンだとEDTAライクなものがほとんどかと思います。 プライマリの細胞では培地で洗ったり、FBS入りのPBSで洗ったりします。 フェノールレッドはPEに影響する恐れがあるので、其の点は注意ですね。

FACSで表面抗原解析のための接着細胞のサンプル調整 削除/引用 No.8294-1 - 2019/10/03 (木) 21:20:58 - FACS 接着細胞を使って表面抗原の解析を行いたいのですがいくつか質問させてください。 BDのFACSサイトで見かけたのですが、トリプシンで細胞を剥がすと表面抗原が壊れる恐れがあるため、別の方法で剥がすと記載がありました。それ以上の具体的な記載が無かったのですが、どの様にして細胞を剥がせば良いのでしょうか？CD44,24やITGB4などを解析しようと思っています。 細胞をはがした後、遠心し、上清を除いたのち再懸濁して抗体反応を行おうと考えていますが、その際、ブロッキングや浸透化などの処理は必要なのでしょうか？（もちろん抗体や抗原に依存するかとは思いますが）。 また、どの様なバッファーを使用すれば良いのか教えてください。（単にPBSでやるより血清やFBSが入ってるほうが良い？） １次抗体を４Cºで反応させた後、遠心してウォッシュを３回ほどして、２次抗体、と言う流れで良いのでしょうか？ 蛍光が一次抗体に付いたものを基本的に使う予定ですが、幾つかの表面マーカーを同時に解析したいため、１つだけ１次抗体と二次抗体をそれぞれ反応させないといけないものがあるので質問しました。 よろしくお願いいたします。

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