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(無題) 削除/引用 No.832-15 - 2012/08/17 (金) 13:14:44 - Edo Harmonia様、ありがとうございました。 他のコメントをいただいた皆様ありがとうございました。 非常に勉強になりました。 私なりに解決したと思いますので、とりあえず解決にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.832-14 - 2012/08/17 (金) 02:28:12 - Edo 皆さんありがとうございます。 私が真面目というコメントもいただきましたが、真面目というよりただ実験が上手くいかなくて他人(学生)のせいにしているだけだと思います。任せる所は任せないとわざわざ夏休みに来ているのに面白くもないだろうと、毎年教えて何回か一緒にしたことは任せてはみるのですが、ずっと見ている訳にもいかず考えられないような失敗をされることもあり、小さなことでも疑ってしまっています。今回の件に関しても、自分でする時も少しぐらいの温度差は無視している時もあるのですが。 とりあえず作ってもらったbuffer類全てから一緒に作り直しました。サンプルも新たに作り直して再度やってみます。 またまた最初の質問からそれましたが人に教える・人に任せるというのも難しいなと実感しています。

(無題) 削除/引用 No.832-13 - 2012/08/16 (木) 22:55:29 - (゜Д゜ 832-1はすごい真面目な人（すくなくとも俺らより）とおもうし、質問にあるような内容が気にかかるということはそれ自体、別に悪い事ではないと思う。その点を認めた上で書くと、普段からこの手の実験をわりとたくさんやってる人間が考えるに、832-1が気にしている所は、あくまで一般論だけど、結果を左右するような影響をもたらすクリティカルなステップではないと思う。実際、加熱の条件は人により違うし、目的によってはあえてしないこともあるし。なので、もし結果に気になるところがあれば、順番としては他の可能性をまずは検討した方がいいとおもう。SDS-sampleの加熱条件に起因するトラブルで、うちらのところで唯一経験してるのはIgGのH鎖とL鎖の間のs-sは加熱が不十分だと切れないで変な分子量に数本強いシグナルが出たときあったこと。で気合いいれて加熱したら元に50KDaと25KDaに戻った。だからIgG含む試料はとりあえず十分に加熱してる。分子内、分子間のS-Sが沢山ある蛋白質（細胞内蛋白質はあんまりそういうのはなさそうだけど分泌された細胞外蛋白質とかはあるな）は一応気をつけた方がいいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.832-12 - 2012/08/16 (木) 22:12:45 - xyz Scientificな議論以外で言い争うのはやめましょう。 ここでけなし合っても不毛だわ。

(無題) 削除/引用 No.832-11 - 2012/08/16 (木) 21:32:08 - がが ＞Harmonia 読解力がないせいで、揚げ足を取る。 自分が詳しくないトピには首を突っ込まないようにしましょう。 あなたの他のトピへのコメントをみると、無責任に荒らしているようにしか思えません。

(無題) 削除/引用 No.832-10 - 2012/08/16 (木) 20:54:17 - Harmonia 「サンプル」を「回収した培養細胞のペレット」と想像しました。 「90℃ぐらいのところですでにサンプルを入れていました」のくだり は、 （本来ならもっと高い温度で行うのだが）90℃ぐらいに熱した試薬 に回収した培養細胞のペレットを入れていました と解釈しましたので、ホットスタート法とでも言いましょうか、 その様な手法があるのかと思った次第です。 そうであれば、操作のタイミングが非常に重要でありましょうから、 具体的にどの様な操作をされたか、それを伺うことで問題点が明ら かにならないかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.832-9 - 2012/08/16 (木) 13:52:55 - Edo 私の説明が不十分だったために論点がそこに移ってしまっているようで、すみません。 c9さんありがとうございます。 私が書きたかったのは、c9さんのおっしゃる通りです。 何人かの方は、私が書いた内容で理解をしていただけたように、やっておられる方ならわかっていただけるかなと思い書きました。ただ、やはりそれでは足りないと思われる方もおられるということも分かり勉強になりました。言葉は難しいですね。 学生には、何回か説明だけでなく実際に一緒に何回かやっているので、説明が不十分だったということはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.832-8 - 2012/08/16 (木) 10:02:26 - c9 昔、一度追加の加熱をしたことがありますが、その時は特に問題はありませんでした。 Harmoniaさん＞ 揚げ足取りとか文句とかではなく、純粋に自分の疑問なんですが、そのような部分をより説明させようとする意図はなんですか？ そこを聞けば、より何かわかるのでしょうか？ 文章を見た限りでは、ＷＢで使うサンプルを９５度に温めたヒートブロック等に入れるという意味意外に考えられるのでしょうか？ 今後、私自身も下のものを指導する機会があるので、その時の参考にしたいと思い尋ねさせていただきました。

(無題) 削除/引用 No.832-7 - 2012/08/16 (木) 08:21:42 - Harmonia はい、ががさんの仰るとおり、揚げ足取りと思われる方は 無視してください。

(無題) 削除/引用 No.832-6 - 2012/08/15 (水) 22:11:22 - がが 揚げ足取りのHarmoniaの意見は無視してください

(無題) 削除/引用 No.832-5 - 2012/08/15 (水) 21:21:48 - Harmonia 揚げ足取りと思われるのはイヤなのですが。 ＞見に行ったら90℃ぐらいのところですでにサンプルを入れていました。 ＞その時点で2分は過ぎていたので、開始時はもっと低かったのかもし ＞れません。 のくだりが良くわかりません。 もう少し説明してください。 「サンプル」とは、何を指していますか？ 「入れる」とは、どこに入れたのですか？ 「その時点で」以下のくだり、本来高い温度ではじめるべきという ことでしょうが、「どういう操作」を高い温度で始めるべきでしたか？

(無題) 削除/引用 No.832-4 - 2012/08/15 (水) 01:03:16 - Edo mon様 ありがとうございます。 過去のトピックを見ていても追加の加熱をしておられる人もいるようだったのですが、確認をしたいなと思って聞かせていただきました。 確かに、ご指摘のように別に原因があるのかもしれません。 今自分で同じサンプルを使って再度試しています。

(無題) 削除/引用 No.832-3 - 2012/08/14 (火) 09:04:00 - mon 追加の加熱は可能です。蒸発していない限りメルカプトエタノールの添加は不要でしょう。汚いバンドには別の原因があるかもしれません。 なお、加水分解し切断されやすいタンパクがまれにあるそうで、65℃15分処理という変性方法もあるようです。

(無題) 削除/引用 No.832-2 - 2012/08/13 (月) 22:45:53 - Edo 追加です。 もし変性が十分でない場合、そのサンプルにもう一度メルカプトエタノールを入れて煮沸をし直すことは可能でしょうか？

SDS-PAGEのサンプルについて 削除/引用 No.832-1 - 2012/08/13 (月) 22:43:25 - Edo いつも勉強させていただいています。 SDS-PAGE用のサンプルを作る際に、いつもサンプルバッファーにメルカプトエタノールを入れて、95℃、5分間煮沸します。今回、夏休みに学部生がラボに来て私の下についていて、他の仕事があるのでサンプル作成を任せて戻ってきた時に、見に行ったら90℃ぐらいのところですでにサンプルを入れていました。その時点で2分は過ぎていたので、開始時はもっと低かったのかもしれません。あまり問題ないかなあと思ったのですが、そのサンプルを使って流した後の結果がいつもと違い汚いバンドだったので、その過程が気になってしまいました。他のステップも学生が出来るというので、任せることが多いのですが、常に見れる訳でもなく他のステップにも問題があるのかもしれませんが。やはり少しの温度差で変性が上手くいかずバンドが汚くなることはあるのでしょうか。

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