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(無題) 削除/引用 No.8347-14 - 2019/10/24 (木) 12:25:30 - moz 「タンパク質（発現）実験」等で検索すると色々あります。 webでも見つかると思います。メーカーカタログも参考になるでしょう。 成書は最初はイラスト入りがわかりやすいと思います。出来れば2~3冊程度覚えるぞとか気合い入れないで気楽に読む（眺める）と良いと思います。2010年くらいの発行なら問題無いでしょう（2000年発行本でも基本的な技術は変わらない）。 価格は\3000以上しますので、ラボで購入してもらうか、大学だと図書館の蔵書を探してみてください？

(無題) 削除/引用 No.8347-13 - 2019/10/24 (木) 10:57:29 - bio+stu+ic 最近、研究を始めたばかりで分からないことが多いです。 今、私がしている実験の内容を勉強できるオススメの本はありますか？

(無題) 削除/引用 No.8347-12 - 2019/10/24 (木) 04:08:45 - おお この質問、困った、、、、 Small ScaleとLarge Scaleといいますが目的にもよります。発現確認をするようなSmall Scaleであれば予定しているLarge Scaleと同等の条件でないこともよくあります。 アドバイスするとしたら、ちゃんと書かれたプロトコールを探してしっかり読んでから質問してくださいくらいかな。。。

(無題) 削除/引用 No.8347-11 - 2019/10/24 (木) 03:13:31 - moz ＞smallとlarge は工程は同じで、培養液などの総量が違うだけなんですね。 ”small scale"という単語からも当たり前ですね。条件を変えたらscale(だけ）を変えたことになりません。 ＞容量が少ないことで実験の負担が減り、一度に多くの条件下でサンプルを検討できるということですか？ 一般的にはそうですが、目的はヒト（実験）それぞれです。 数多くの異なるサンプルを同一手法で試すときにも使います。

(無題) 削除/引用 No.8347-10 - 2019/10/24 (木) 03:04:25 - moz もしかしてbio stu icさんとbio+stu+icさんは異なる方ですか？ 同じ方なら、実際に行った作業結果と予定（希望）を分けて記載してください。 ＞カラムを通してタンパク質を生成（精製ですね？）します。その後、... 精製した（過去形）のですね？それとも予定ですか？ 予定の場合、CBB染色したとは？ 大腸菌菌体まるごと、あるいは超音波処理後のペレットをSDS−PAGE＞CBB染色したのですか？ (8)binding bufferの組成は？カラムはどのようなものですか（Ni-NTA?） (9)目的タンパクが可溶化していないとカラムに結合出来ません。懸濁という操作は、ただ混ぜただけの操作です。目的タンパクがbinding buffer中で可溶化している事を確かめましたか？どのように確かめましたか？ 質問が曖昧＝実験の要所が分かっていないと感じます。いろいろな成書がありますので、一度勉強したほうが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.8347-9 - 2019/10/24 (木) 02:20:02 - bio+stu+ic >[Re:7] mozさんは書きました : > small scaleとは大量生産前の予備実験ですので、すべての工程を指します。培養法だけでなく精製法の妥当性（適合性）・諸条件を検討したりします。 > もちろんスケール比は調整しますが、大量生産時の目的タンパクの挙動がsmall scaleと一致しないこともあります。温度変化に掛かる時間やエアレーションの違いかなと思っています。 smallとlarge は工程は同じで、培養液などの総量が違うだけなんですね。 容量が少ないことで実験の負担が減り、一度に多くの条件下でサンプルを検討できるということですか？

(無題) 削除/引用 No.8347-8 - 2019/10/24 (木) 02:15:21 - bio+stu+ic 本培養後のものを遠心分離し、PBSで懸濁し、超音波処理後のものを上清、ペレットに分け、ペレットはbinding bufferで懸濁し、カラムを通してタンパク質を生成します。 その後、SDS-PAGEして、CBBで染色して、過去に実験した先輩のデータやアミノ酸配列がわかるソフトから目的の大きさののタンパク質は分かっています。

(無題) 削除/引用 No.8347-7 - 2019/10/23 (水) 18:01:53 - moz small scaleとは大量生産前の予備実験ですので、すべての工程を指します。培養法だけでなく精製法の妥当性（適合性）・諸条件を検討したりします。 もちろんスケール比は調整しますが、大量生産時の目的タンパクの挙動がsmall scaleと一致しないこともあります。温度変化に掛かる時間やエアレーションの違いかなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.8347-6 - 2019/10/23 (水) 17:55:00 - moz ＞目的の大きさのタンパク質がペレットに多くあります。 (5)超音波処理後の不溶性画分にあるということですか？ (6)どのような溶液に菌体を懸濁して超音波処理しましたか？ (7)目的の大きさのタンパク質はWBで確認したのですか？ゲルの染色ですか？つまり、目的の大きさのタンパク質が目的タンパクである確証はありますか？

(無題) 削除/引用 No.8347-5 - 2019/10/23 (水) 17:50:22 - moz pETシステムのマニュアルは読んだことがありますか？ 勉強になりますよ。

(無題) 削除/引用 No.8347-4 - 2019/10/23 (水) 17:49:09 - moz 基本的なタンパク発現に影響する情報が不足しています。 (1)どのような発現系（ベクター・宿主株）をお使いですか？ (2)培地は何を使っていますか？ (3)どのような培養器を使っていますか。三角フラスコですか。フラスコ容量と培地量はどれほどですが？回転数は？ (4)IPTG 150uLとは終濃度どれほどですか？

small scale 削除/引用 No.8347-3 - 2019/10/23 (水) 15:30:43 - bio+stu+ic small scaleとは発現誘導までの過程のことを言うのですか？それとも、培養液の溶液を少なくして行うタンパク精製のことを言うのですか？ lb培地、抗生物質、菌液の容量の比がlarge scale時と同じ状態で総量を減らした時、ペレットの懸濁に用いるPBS、binding bufferもlarge scale時の抗生物質、lb培地、菌液の容量と同じ比になるように量を調整しますか？

大腸菌のタンパク質精製 削除/引用 No.8347-1 - 2019/10/23 (水) 15:19:53 - bio stu ic 現在ChiE,ChiF,ChiFΔ1のタンパク質の精製を行なっています。 methodとしては前培養37℃ 17.5h→本培養37℃ 2h30min→OD600で0.7程度ならIPTGを150ul加えて20℃でovernight培養しています。 この時、目的の大きさのタンパク質がペレットに多くあります。 そこで質問なんですが、 �@目的のタンパク質を上清に取るためにコールドショック法を考えているのですが、16℃〜25℃の間で培養すると良いという文献を見たのですが、これはiptgを加えた後の培養の温度ですか？それとも前培養、本培養の温度のことですか？ �Asonication前後のサンプルを電気泳動することで、sonicationがしっかり行われ、目的の大きさのタンパク質が発現しているか、上清かペレットのどちらにあるか確認することはできていますか？

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