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Re:CRISPR-Cas9を使ったノックイン方法でおすすめ トピック削除
No.8415-TOPIC - 2019/11/17 (日) 09:26:43 - 北里柴三郎
いつも勉強させて頂いております。
この度CRISPRを用いてGFPを遺伝子Aの下流に組み込みたいと考えております。
用いる細胞はJurkat T cell, CEM T cell, Molt4 T cell等のTセルラインを検討しています。

HITI法（PMID: 27851729）の論文を読み、簡便かつ効率が良さそうでしたのでこちらの方法を試そうと考えていたのですが、
半年程前に立てられましたスレッド
"CRISPR-Cas9を使ったノックイン方法でおすすめ"
を拝読いたしましたところ、HITI法の効率があまり良くないとの印象を受けました。しかし実際のところはどうなのでしょうか。

どなたか実際のご経験をお聞かせ頂けますと大変有り難いです。
どうぞよろしくお願いいたします。
　
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No.8415-9 - 2019/11/18 (月) 10:41:36 - 北里柴三郎
HITI様

はい、もちろんアップデートさせて頂きます。
HITI法は効率が良くないという情報有難うございました。

(無題) 削除/引用
No.8415-8 - 2019/11/18 (月) 05:40:35 - HITI
GFPを組み込まれるなら、ノックイン効率がGFPにより可視化できますし、またソーティング出来るでしょうから例え効率が低くてもソーティング出来るのでいいですね。

私の実験ではどうしてもノックイン細胞が作りたいので、ぜひアップデートがありましたらお知らせ頂けると幸いです。

(無題) 削除/引用
No.8415-7 - 2019/11/18 (月) 03:06:38 - 北里柴三郎
HITI様

教えてくださり有難うございます。
チェックしてみます。
様々な手法が精力的に開発されていますね。

(無題) 削除/引用
No.8415-6 - 2019/11/17 (日) 23:24:08 - HITI
Tild-CRISPRを検討されてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.8415-5 - 2019/11/17 (日) 13:21:09 - 北里柴三郎
HITI様

早速ご回答頂き有難うございます。
二名の方がHITI法が上手く行っていないということになりますね。
時間はかかりますがPITIhを試した方が良いのかなと感じております…

(無題) 削除/引用
No.8415-4 - 2019/11/17 (日) 12:52:46 - HITI
いえ、私はトピ主ではないです。

今はPITIh法に変えていますが、まだ結果は出てはいません。
HITIもPITIhも、repairing templateを時間を掛けて作っても、うまくいかないと時間をかなりロスしますので、PITIhでもうまくいかなければPrime Editorを試すかもしれません。

ただPrime editorはGFPほど大きなものが挿入できるかはわかりませんが、私の場合は50 bpほどのタグなので問題はなさそうです。

(無題) 削除/引用
No.8415-3 - 2019/11/17 (日) 11:48:09 - 北里柴三郎
HITI様

貴重なご意見有難うございます。

HITI様は前回のスレッドのトピ主(ノッキン様)でしょうか？
別の方でしたら、二人の方が上手く行かなかったということになりますね。
何かコツのようなものがあるのかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.8415-2 - 2019/11/17 (日) 11:38:04 - HITI
HITIは私の場合には全くだめでした。

targetにもよるのだとは思いますが、私は3度別のgRNAで試しましたが、それでもだめでしたね。

Re:CRISPR-Cas9を使ったノックイン方法でおすすめ 削除/引用
No.8415-1 - 2019/11/17 (日) 09:26:43 - 北里柴三郎
いつも勉強させて頂いております。
この度CRISPRを用いてGFPを遺伝子Aの下流に組み込みたいと考えております。
用いる細胞はJurkat T cell, CEM T cell, Molt4 T cell等のTセルラインを検討しています。

HITI法（PMID: 27851729）の論文を読み、簡便かつ効率が良さそうでしたのでこちらの方法を試そうと考えていたのですが、
半年程前に立てられましたスレッド
"CRISPR-Cas9を使ったノックイン方法でおすすめ"
を拝読いたしましたところ、HITI法の効率があまり良くないとの印象を受けました。しかし実際のところはどうなのでしょうか。

どなたか実際のご経験をお聞かせ頂けますと大変有り難いです。
どうぞよろしくお願いいたします。
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