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(無題) 削除/引用 No.8425-8 - 2019/12/10 (火) 09:37:01 - 4k おおさんのご質問に関して、こういう流れではないでしょうか。 ・今の実験ではb-actinが一番分子量『が小さく約42 kDaなので』、『Pre-stainedの』マーカーの４０kDaのあたり『がゲルの下端あたりまで来たら』泳動は止めています。 →泳動は40 kDa『辺りのマーカーがゲルの下端を』超えて流しても良いかと思います 実際、アクチンはコントロールとして流しており、それをまともに見るためにはどうしたらいいか？というご質問だと思うので、40 kDaが流れきるぐらいまで流すのはやや危険な気もしますが…。 サンプルを減らすのが一番な気がしますね。

(無題) 削除/引用 No.8425-7 - 2019/12/10 (火) 08:58:50 - おお >今の実験ではb-actinが一番分子量が少ないので、マーカーが４０kDa >泳動は40 kDaを超えて流しても良いかと思います。 すんません、理解が及ばないのでわかっている方解説願いますか？４０kDaのマーカーはどこまで流しても４０kDaだし、、、

(無題) 削除/引用 No.8425-6 - 2019/12/09 (月) 14:06:18 - ぷりん ＞＞泳動距離が短すぎるのでしょうか？ 泳動は40 kDaを超えて流しても良いかと思います。もちろん、流し切ってタンパクが流出してしまっては意味がありませんが・・・ バンドが横に繋がってしまうのは、おそらく泳動時のタンパク量が多いからだと思います。泳動するタンパク量を少なくしてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8425-5 - 2019/11/21 (木) 12:59:58 - 独り言 バンド同士が横で繋がるのは、そのタンパク質が多量にあるからです。 どうしても繋がらないようにしたいのであれば、 １、アプライする量をその5分の1ぐらいにする。 ２、もしくはウェル間の幅が広いコームを使用する です。

(無題) 削除/引用 No.8425-4 - 2019/11/20 (水) 22:36:12 - まっくろん 　私も自分で同じ現象が観察されたら、xcrtyg7さんやおおさんが仰るようにサンプル量を疑うと思います。それが原因であれば、条件検討としてゲルに1/2量ずつロードして適正量を決められると思います。ただ、同一メンブレンで標的とローディングコントロールを見る場合、サンプル量を下げると標的が検出出来ない可能性も出くるかとおもいます。その場合、自分であればより発現量の低いコントロールに変えるか、ポンソー染色などタンパク質染色での補正を検討すると思います。

(無題) 削除/引用 No.8425-3 - 2019/11/20 (水) 15:12:08 - おお シグナルが強すぎるためつながっているなら、抗体濃度（１次、２次とも）下げたり弱いヶミルミ試薬使ったりするといいでしょう。 ゲルに原因がある場合もあります。たとえばスタッキングと分離ゲルの間がうまく重合してないとか。プレートが汚い場合はそういう傾向が強いです。 あるいはゲル濃度が高すぎるとか、のせる量が多すぎるとかでもそういうことが起こったりしがちです。

(無題) 削除/引用 No.8425-2 - 2019/11/19 (火) 22:07:59 - xcrtyg７ １、タンパク質多すぎ。 ２、サンプルをアプライしてから通電開始まで長い時間放置した。（30min<とか） 3. 泳動をかなりゆっくり流した。（低い電流・電圧）

western blotting 削除/引用 No.8425-1 - 2019/11/19 (火) 20:19:37 - kei ウェスタンでのローディングコントロールにb-actinをおいて実験をしているのですが、 毎回b-actinだけがレーンを超えて横につながってしまいます。 今の実験ではb-actinが一番分子量が少ないので、マーカーが４０kDaのあたりまで来たら泳動は止めています。 泳動距離が短すぎるのでしょうか？

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