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(無題) 削除/引用 No.8465-15 - 2019/12/05 (木) 09:39:33 - ちき 話はそれますが、やはり2N、4Nと表記する人が多いのでしょうか。個人的には、2C、4Cとしたいところですが。 あと、異数性のがん細胞株(の細胞周期解析)などは本当はどう書くべきなのかも、ちょっと気になります。

(無題) 削除/引用 No.8465-14 - 2019/12/05 (木) 04:56:52 - おお https://journals.plos.org/plosone/article/figure?id=10.1371/journal.pone.0112641.g002 https://www.researchgate.net/figure/Analysis-of-DNA-content-of-COS-7-cells-after-treatment-with-C-2-ceramide-ET-18-OCH-3_fig5_11071571 Cos7使っている論文も調べてみればいいのに。 確かに論文と同様に再現できるかという話はあるけど。 いろいろみてみると（COS以外も含めて）G1とG2Mのアレストがあまりきかなくって台形に見える場合とかG1のあれすとが効いていてG2Mがあまり聴いてなく２nにピークで４nまでダラダラとした感じになってたり。 シグナルの出始めとなくなる直前などの位置で２nと４nに相当するのかなども見てみたらいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8465-13 - 2019/12/04 (水) 08:29:09 - hoechst33342 おおさん、Mさん、上田さん、大変示唆に富むコメントをお寄せくださり、ありがとうございます。 巨核球を染めた場合にも生細胞でした。 多核なので、多核な成熟した細胞は私のプロトコルでは染まりやすかったのかもしれないですね。 P糖タンパク質についての考察、大変興味深かったです。 私は気にしたことはありませんでしたので、今後、固定をしてみたり、検討してみます。 Mさまの、細胞による、というコメントも大変気になります。 私の培養細胞はCOS7で増殖は早いですが、なにかしら細胞周期を乱したり調整する薬剤をコントロールに置くことも大事だなと思わされました。 みなさま、ありがとうございました。 またアップデートさせていだだきます。

(無題) 削除/引用 No.8465-12 - 2019/12/04 (水) 06:02:12 - 上田 きれいなピークが出るかどうかは細胞による、ってことはないでしょうか。培養細胞でトリプシン処理してエタノール固定後、PI染色で細胞周期をみたことがありますが、同じように処理してもピークがきれいに出る細胞と緩やかな山のようなピークになってしまう細胞がありましたので。

(無題) 削除/引用 No.8465-11 - 2019/12/04 (水) 05:49:41 - M すいません。おおさんと一部かぶってしまいました。お許しを。

(無題) 削除/引用 No.8465-10 - 2019/12/04 (水) 05:46:22 - M ヘキストの場合、細胞によってはP-glycoproteinなどABC 膜輸送タンパクにより排出されてしまい、上手く染まらないかもしれません。どうしても生細胞でという事なら、ABC 膜輸送タンパクの阻害剤を併用すると良いかもしれません。一回アルコールで固定、透過して染めてみれば、生細胞におけるヘキストの細胞外排出が原因かどうか見当がつくと思います。 技術的には、巨核球のpolyploidyの方が格段に難しいので、巨核球で大丈夫なら普通の細胞でも大丈夫と思います。巨核球の場合はログで見る事が多いですが、普通の細胞で細胞周期をみる場合は通常リニアですね。ちなみに、巨核球の場合も、同じヘキストを用いた生細胞での染色ですか？ もしお使いの細胞の増殖が早く、S期の細胞が多い場合は、2N4Nのピークが見えなくて、全体としてダルなプロットになる可能性も無くはないです。もし細胞周期を薬剤や血清飢餓で止める事ができる細胞であれば、G1やG2で止めてみると、シャープなバンドが見れるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8465-9 - 2019/12/04 (水) 05:23:28 - おお >比較にはならないとは思いますが、DAPIを免疫染色で用いており、それでは5分もかからないでDAPI染色は終えています。 比較にはなりませんよ。トリプシン処理したといえ生細胞なんですよね。hoechst 33342は膜透過性があるとは言われているけど、透過性に関してはあまり強くないようです。またP-glycoproteinなどの発現量などにより異物の排泄力が高い細胞では核に到達するのに時間がかかりそうです。 少し染色に時間をかけるかよわい界面活性剤で膜に穴を開けるとか工夫をしてみてはどうかと思うのです。

(無題) 削除/引用 No.8465-8 - 2019/12/04 (水) 03:22:06 - hoechst33342 >単にG1/G0、S、G2/Mの比率が知りたいならFlowJoにも計算する機能はありますよね ちき様、 はい、Flowjoには計算機能があります。 ただ計算するために必要な　”ふさわしい” ピークが観察できないことが私の問題です。 傾向顕微鏡では見ていませんが、高濃度のヘキスト染色ではフローサイトでシフトが強く観察されるので、染まっていることは間違いないのですが、なぜダルなピークしか出ないのかが疑問です...。 TSさま、 ヘキスト染色後に長く時間を置く必要もないので洗浄しています。 洗浄しないとPIなんかでは生細胞もゆくゆくは染まっていくので、同じようにしています。

(無題) 削除/引用 No.8465-7 - 2019/12/03 (火) 13:43:03 - TS あまり詳しい方じゃないですが、PIで細胞周期を見たことはあります。ヘキストは洗浄しないとだめなんですか。PIは洗浄してあまり時間がたつと抜けてくるのでたいてい洗浄はしませんね。

(無題) 削除/引用 No.8465-6 - 2019/12/03 (火) 11:57:47 - ちき 以前参考にしていたflow cytometryのプロトコルに「うまくいかない場合、流すサンプルを必ず蛍光顕微鏡で確認しろ」と書かれており、実際そのおかげでトラブルシュートが素早くできた経験があります。DAPIだと固定が前提ですし、別の実験系なのであまり参考にはならないかと。 単にG1/G0、S、G2/Mの比率が知りたいならFlowJoにも計算する機能はありますよね(使ったことないのですが、検索するとそう書かれているので)。それ以上の解析が必要なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8465-5 - 2019/12/03 (火) 11:02:32 - hoechst33342 みなさん、ありがとうございます。 私はこの実験を行う前に、骨髄の巨核球のポリプロイディ解析を行っていたことがあります。 同じ濃度で、同じように染めていて、その際にはマジョリティの16Nのピークがきちんと見え、それ以外に32N、64N、8N、4N、2Nが見えていました。 巨核球は多核なのでその最適化されたプロトコルは2倍体の細胞では不十分ということでしょうか...？ 顕微鏡で見たことはありませんでした。 比較にはならないとは思いますが、DAPIを免疫染色で用いており、それでは5分もかからないでDAPI染色は終えています。 細胞周期解析には特別なフローサイトの解析ソフトも必要だったりしますか？ 質問を重ねてしまい恐縮です。 私はDivaソフトでデータを取得し、その解析をFlowjoで行なっています。

(無題) 削除/引用 No.8465-4 - 2019/12/03 (火) 10:35:16 - おお >蛍光顕微鏡でちゃんと核染色が確認できますか? 質問者ではないですが、生細胞の核を可視化するために培地にhoechst33342をいれたことがありました。５分では染まり方がまだらだったように記憶しています。

(無題) 削除/引用 No.8465-3 - 2019/12/03 (火) 08:58:36 - ちき 蛍光顕微鏡でちゃんと核染色が確認できますか? どうしてもだめならエタノール固定ですかね。

(無題) 削除/引用 No.8465-2 - 2019/12/03 (火) 04:24:53 - おお https://www.bdbiosciences.com/ds/pm/tds/561908.pdf https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37165?SID=srch-srp-R37165#/R37165%3FSID=srch-srp-R37165 >ヘキストで5分染色後 いくつかプロトコールをみると３０分以上染色しているようです。

hoechst33342での細胞周期解析 削除/引用 No.8465-1 - 2019/12/03 (火) 04:09:53 - hoechst33342 hoechst33342での細胞周期解析を試みたいです。 しかし、きちんと2Nと4Nのピークが見えず、dullといいますか、いわゆるフローサイトで膜タンパク質の発現を見たかのように大きなこんもりした山が見えるだけです。 何が原因でしょうか？ するどいピークが二本出ることを期待していたのですが... ヘキストの濃度もいくつか振っており、そのどれでもだめでした。 実験方法は、培養細胞をトリプシンで剥がし、遠心、洗浄、再懸濁し、ヘキストで5分染色後、遠心、洗浄でFACS Celesta解析です。 FSC、SSCゲートをいつものように作製し、目的の集団にゲート、BV421用のフィルターを使って検出しています。BV421はログもリニアも試しました。 改善点や誤っている箇所がありましたらご指摘くださいますようお願い申し上げます。

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