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(無題) 削除/引用 No.8540-16 - 2020/01/06 (月) 13:52:37 - AA 遺伝子組み換えが起きていることを確認したいだけなのか、 目的遺伝子の発現量を定量的に解析したいのか、 実験の目的がうまく伝わっていないように思います。 レビュワーからのコメントということですが、どういう文脈なのでしょうか？ 組換がちゃんと起きていないから表現型がないのではないか、 というコメントなのであれば、その後に指示されている実験とは違っていても合理的に説明が付けばそれで良いと思います。 欠損型mRNAと野生型mRNAの量比を定量的に測定しろ、ということであれば定量するしか無いかもしれません。 BloodにERp57をPf4-CreでKOした論文が出ているようで、最初のFigでRT-PCRの結果を載せています。 これは単にバンドの出るでないだけでKOを示していますが、これではだめなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8540-15 - 2020/01/06 (月) 13:27:24 - ぽんこ asan様、 意味がない云々ではなく、レビュアーからのコメントがあった以上やらねばならないことは先に申している通りです。ノックアウトマウスで遺伝子が必ずしもゼロにならないことも当然存じげている次第です。 私がお聞きしたいのは質問に対する直接的なご意見です。 asan様がご丁寧に書いてくださったことは重々存じております。 その上で、mRNAの発現を見るために、という質問をしています。

(無題) 削除/引用 No.8540-14 - 2020/01/06 (月) 13:24:46 - ぽんた AAさま、ありがとうございます。 Pf4Creを使用しています。 一部の白血球にも発現するようですが、それがplatelet-associated leukocytesであることの否定はできません。私もmTmG;Pf4Creマウスのフローサイトを行いましたが、血小板分画に多くのレポータ陽性細胞を認めております。

(無題) 削除/引用 No.8540-13 - 2020/01/06 (月) 09:38:58 - asan >私の質問は、皆さまがノックアウトマウスを作製し、そのmRNAの発現量を見る必要性に駆られた場合、どこにプライマーを設計されますか？ この場合見てもあまり意味がないのでは？ということが個人的な見解です。変化してれば変化するというだけだし、それが0-100にならなかったら飛び効率を反映してるとも言い難いし、結局何を評価したいかでしょう。deletionした部分のmRNAが減ってることを議論したならdeletionの部分のみに絞れば確実にその量を評価出来ますが、conditional deletionで雑多な細胞集団でqPCRをやるとノイズも拾うのでそれなら第一選択的には、飛び効率を議論するなら通常はDNAを測定すればいいからです。 >ご使用のCreマウスは巨核球以外に全くCre発現無いのでしょうか？ にも絡みますが、要するにcreがワークしたら当然影響のでる細胞集団の評価をするしかない、基本的にはそういうことでしょう。creが機能したら当然起こりうる変化をなんかしらの正当性のある方法で証明することは科学的には当然の指摘ですからね。マウスのフェノタイプが予想外にないなら、その辺の評価を行なっていくしかないかと。表面マーカーでFACSやるでもphenotypic assayで既知の影響や変化を示すでもなんでもいいとは思いますが、少なくともあなたが解析したい現象とは別の形で系が機能してることを示せば良いのではないかと思います。 質問の直接的な回答ならば、deletionの部分にかければ当然発現は無くなるので、理論上は飛び効率の定量データになるでしょうが、qPCRはサンプルの状態によっても結構ブレたりすることもあります。それ以外の領域にかけるとfloxの設計の仕方によってはmRNAは残ったり残らなかったり。フィードバックが起きてmRNAは逆に上がったりすることもあるので結論は出ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.8540-11 - 2020/01/06 (月) 09:00:29 - AA ご使用のCreマウスは巨核球以外に全くCre発現無いのでしょうか？ 間接的にはなりますが、他の器官のゲノムで確認するのも良いかもしれません

(無題) 削除/引用 No.8540-10 - 2020/01/06 (月) 07:31:02 - ぽんこ F12さん、大変示唆に富むコメントをお寄せくださり、ありがとうございます。 > floxされている部分を含めた全長でRT-PCRをかけます。qPCRが難しい場合は、普通のPCRでまずは見ると思います。 実はレビュアーにもそれを行うように、とコメントがありました。 ただ全長が長すぎるためなのかPCRがかかりませんでした...。 ＞”KOにより巨核球が完全に死んでしまう状況だと、組み換えを逃れたわずかな巨核球のみが生き残り、そこからfloxが残ったmRNAを持つ血小板が産生されます。” 大変示唆に富むコメントをありがとうございます。実は私もその可能性を考えていました。 私がノックアウトした遺伝子では血小板表面のタンパク質の構造がおかしくなり、そのためその異常な血小板は脾臓や肝臓にてクリアランスされます。なのでその血中にいる血小板はクリアランスする前のものか、組換えが起こらなかった血小板がドミナントになっているのでは？と考えていました。 私もF12さんの考えに同意しています。なので、ボスに血小板のクリアランスを抑えるためにマクロファージをクロドロネートリポソームで除去したいとは言っているのですが、あまりいい顔はしません。 私の仮説ではマクロファージを除去することで血小板のクリアランスを抑え、血中に組換え血小板がドミナントになり、遺伝子のノックアウトも確認できるのでは？と考えています。 > floxされている部分の上流と下流（5' UTRとexon-3とか）にプライマーを設計すると良いと思います。組み換わったmRNAの場合、PCRがかかったとしても、産物のサイズが小さくなりますから、ゲルに流してサイズを見れば、組み換え効率がわかると思います。 ありがとうございます。おっしゃる通りです。 もう少しPCRの条件を工夫して、全長とはいなかくても、せめてfloxされた領域全てを増やすようなプライマーを設計し直してみます。 大変勇気づけられました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8540-9 - 2020/01/06 (月) 06:20:37 - F12 > 私の質問は、皆さまがノックアウトマウスを作製し、そのmRNAの発現量を見る必要性に駆られた場合、どこにプライマーを設計されますか？ 自分であれば血小板の場合はタンパクで見ますが、あえてmRNAで見るならば、floxされている部分を含めた全長でRT-PCRをかけます。qPCRが難しい場合は、普通のPCRでまずは見ると思います。KOでもfloxされた部分をスキップしてRNAが転写される可能性があるので（トピ主さんが指摘されている通りです）。 > floxされた領域内にプライマーを設計すると、KOではそもそもバンドは絶対に出ないことになるので、mRNAの”発現量”をKOのサンプルで見ることは不可能ということになります。逆にそれでPCRのバンドが出てしまえば、それはWTのゲノムがコンタミしていることを意味していて、それでは目的に適わないのではないかと私は考えます。 ボスが言っている事を私なりに解釈すると、「KOではそもそもバンドは絶対に出ないこと」自体が確認できてないので、そこからやり直しなさいという事かと思います。例えばPF4-creで巨核球にKOを誘導している場合、KOにより巨核球が完全に死んでしまう状況だと、組み換えを逃れたわずかな巨核球のみが生き残り、そこからfloxが残ったmRNAを持つ血小板が産生されます。exon-1/2内にプライマーを設定してPCRがかからなければ、組み換え自体はワークしていると判断できますよね？　その上でexon-20の増幅産物の意義を検討し、そのKOで行けるかどうか考えることになるのでしょう。タンパクでの検出はできた方が良いですね。 > 一方、私はfloxされた領域外にプライマーを設計しました。 このストラテジーでも良いと思いますが、exon-20ではなくて、floxされている部分の上流と下流（5' UTRとexon-3とか）にプライマーを設計すると良いと思います。組み換わったmRNAの場合、PCRがかかったとしても、産物のサイズが小さくなりますから、ゲルに流してサイズを見れば、組み換え効率がわかると思います。

(無題) 削除/引用 No.8540-8 - 2020/01/06 (月) 02:28:45 - ぽんこ AAさん、ありがとうございます。 巨核球の段階でのゲノミックPCRは2度ほど試しましたが、技術的に大変困難でした。 CD41ビーズで骨髄からMACSしても、取れてくるのは巨核球だけでなく、血小板が骨髄白血球にペタペタついたplatelet-associated leukocytesがコンタミしてきます。むしろそのコンタミの方が数的に圧倒しています。そのため、ゲノミックPCRでは遺伝子欠損の確信が持てません。 巨大かつCD41+な巨核細胞のソートは今後してみたいとは思っています。 話が本質とはズレてきてしまいましたが、 私の質問は、皆さまがノックアウトマウスを作製し、そのmRNAの発現量を見る必要性に駆られた場合、どこにプライマーを設計されますか？ もし私のボスが言うように、floxされた領域内にプライマーを設計すると、KOではそもそもバンドは絶対に出ないことになるので、mRNAの”発現量”をKOのサンプルで見ることは不可能ということになります。逆にそれでPCRのバンドが出てしまえば、それはWTのゲノムがコンタミしていることを意味していて、それでは目的に適わないのではないかと私は考えます。 一方、私はfloxされた領域外にプライマーを設計しました。 このプライマーで検出できるPCRバンドは（もちろんWTのゲノムがコンタミしているかは判断できませんが、）そもそもの目的であるmRNAの”発現量”をKOのサンプルで見ることは可能だと思うのです。 うまく言葉では説明できてしないのかもしれませんが、もし私ならこうする、という考えをお持ちの方がいらっしゃいましたら、どうかご教授いただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.8540-7 - 2020/01/06 (月) 00:21:47 - AA 巨核球の段階で単離するのは難しいですか？ 確認のために1回だけでもできれば安心できると思います

(無題) 削除/引用 No.8540-6 - 2020/01/05 (日) 22:12:37 - ぽんこ 皆さんありがとうございます。 血小板には核がありませんので、飛んだ飛ばないのgenomic PCRはできないんです。 ウエスタンは抗体がないので出来ていません。発現量も検出限界以下のような気もしています。 血小板にはmRNAはありますので、mRNAからノックアウト効率を見れないかと思い、qRT-PCRを行いました。

(無題) 削除/引用 No.8540-5 - 2020/01/05 (日) 18:31:21 - asan KOでmRNAが完全になくなるかどうかはケースバイケースなので、通常はmRNAの発現量を深く議論することはしないと思います。 creの飛び効率を含めてfloxで飛んでるかどうかを見るならとんだ場所と外で通常のPCRをしてとび効率を概算するべきでしょう。 ノックアウトはWBで評価すべきでもありますが、厳密に言うと、ノックアウトしたことによって当然起こりうる表現型がきちんと出ることで矛盾するかどうかのほうが重要になってきます。WBでも抗体のエピトープによっては残ることもあるし、あくまでそのタンパク質が出なくなることによる表現型による評価でしょう。 PCRは正直トリッキーな解釈にもなりうるのでターゲッティングから作製した場合はサザンまで一応やらないと納得いかない、という先生もいまだにいますよ。

(無題) 削除/引用 No.8540-4 - 2020/01/05 (日) 14:57:57 - 独り言 ちょっとまって。mRNAの発現解析をしているのですか？ 遺伝子発現でなく、Floxがちゃんと飛んだかどうかを見るのであれば、ゲノム抽出してgenomic PCRじゃないですか。 いずれかloxpの外側の設計（エキソン１と２の外側）で設計してFloxが飛んだら500bpぐらいの増幅が予想される場所と、 前か後ろいずれかのloxpをはさんだプライマーセットで、飛ばない場合にPCR増幅されるもの。 これを使って、飛んだか飛んでないか確かめてないのですか？

(無題) 削除/引用 No.8540-3 - 2020/01/05 (日) 13:18:29 - おお あと、WBは検討しないのですか？

(無題) 削除/引用 No.8540-2 - 2020/01/05 (日) 10:39:43 - おお エクソン1と2を飛ばして、転写が起こっても機能する蛋白が出来ないというのが狙いですよね。

KOマウスでの標的遺伝子ではどこにプライマーを設計がよいか 削除/引用 No.8540-1 - 2020/01/05 (日) 10:25:55 - ぽんこ 明けましておめでとうございます。 早速質問させてください。 私は血小板に遺伝子欠損マウスを扱っています。 ただ予想に反してそのマウスは異常を示しませんでした。 そこで、コンディショナルに遺伝子をかく細胞を回収し、遺伝子発現をみると、野生型と同程度でした。 この解釈としては、血小板では遺伝子がノックアウトされていない、または野生マウスでも血小板ではそもそもその遺伝子があまり発現しておらず、バックグラウンドレベルではないか、と考えています。事実、野生型血小板で立ち上がってくるqRTーPCRのサイクル数は30以降でした。 血小板の単離そのものは長く従事してきていますので、問題はなく、赤血球のコンタミすら検出限界以下です。ちなみに末梢血から血小板を単離しています。 ボスには遺伝子がノックアウトされていないはずはないだろうとのことで、プライマーのデザインに話が移りました。 私の目的は、血小板でその遺伝子がノックアウト（遺伝子が発現していないか）されているかどうかなので、floxedしている領域（エクソン1と2）は敢えてプライマーデザインサイトから外し、qRTーPCR用プライマーはエクソン20に設計しました。ただ、ボスがそれではだめで、エクソン1と2に設計しないと目的が叶わないのでは？と言われてしまいました。 私も不安になりはじめ、どこに設計すべきか自信がなくなってきました。 皆さまは同じような状況の時、どこに設計するのが正しいでしょうか？ ボスの方法では、血小板以外のコンタミを知ることはできるとは思いますが、わたしはそれが目的ではありませんで、非常に混乱してしまいました。

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