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(無題) 削除/引用 No.8723-23 - 2020/03/20 (金) 02:40:36 - HA抗体 r様、ありがとうございます。 強制発現細胞ではなく、ノックイン細胞ですので、ドナーテンプレートをタグの変更だけのために作り変える手間と時間を惜しむため、良質のHA抗体をお聞きするためにトピックを立てました。 当該タンパク質に対する抗体では検出できません。 プラスミドを一過性に強制発現細胞のライセートにはこの抗体はワークしますので、おそらく内在性タンパク質の発現が極めて低いものと考えています。 ＞HA-tag抗体でendoのものを、の意味もよくわからないです。mockトランスフェクションの細胞とくらべて問題の130kのシグナルの強度は増強してますか。 私が行なっているのはトランスフェクションではなく、相同組換えを利用したノックインです。 タグを興味ある遺伝子にノックインして内在性の融合タンパク質を作る細胞の樹立を行なっています。 ノックインされたラインでは130kのノンスペバンドの強度はほぼ変わらずです。 > HA-tag付き蛋白質を発現させて検出出来ることを確認するそれ自体が目的になっているような感じがするのですが。 「発現させて」ではなく、発現しているものにタグを付けました。 文献上では強制発現させると130kDに前駆体、110kDが成熟体として報告されています。 130kDがメジャーなバンドです。 内在性タンパク質の挙動となると、そうはならないと考えています。 もしかしたら130kDはマイナーかもしれません。 そういう確認をするためにも前駆体、成熟体どちらのタグ付き内在性タンパク質の発現や局在を見るため、良質のHA抗体を探していました。

(無題) 削除/引用 No.8723-22 - 2020/03/19 (木) 23:06:29 - r HA-tagでないとだめなの？HA抗体で邪魔なシグナルが出るならほかのタグにすればいいだけでは。あと当該蛋白質にたいする抗体使うのはだめなの？。抗体がちゃんとしてて、でもexoで強制発現させても検出できないなら、その細胞で発現させることは適切でないのではないかと。HA-tag抗体でendoのものを、の意味もよくわからないです。mockトランスフェクションの細胞とくらべて問題の130k のシグナルの強度は増強してますか。 HA-tag付き蛋白質を発現させて検出出来ることを確認するそれ自体が目的になっているような感じがするのですが。

(無題) 削除/引用 No.8723-21 - 2020/03/19 (木) 13:02:25 - HA抗体 エンドトキシン様、 ＞みさんも仰るように130KDaは無視でオッケーの問題ですね、これ...。 プロフォームが130に出るので、130kのノンスペを避けたいんです。 ただここでいくつか抗体を提案していただいたので、まずはそれで検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.8723-20 - 2020/03/19 (木) 12:39:18 - エンドトキシン みさんも仰るように130KDaは無視でオッケーの問題ですね、これ...。 なんか、返事してる人が二人いるのかな？っていう位に言ってることがコロコロ変わってるし、問題も解決したようなので、外野は黙っておきます。

(無題) 削除/引用 No.8723-19 - 2020/03/19 (木) 09:21:04 - HA抗体 エンドトキシン様、 ありがとうございます。 > これは、あなたの分子に対する抗体が存在していて、しかしその抗体でWBをしても検出できないということですよね？ はい、その通りです。 > 確認したいのですが、トピ主さんの実験は、強制発現（pcDNAなんかに興味のある蛋白のCDSをHA-tag配列と共に組み込んで、発現ベクターを作り、これを293細胞にTransfection）の系じゃないんですよね？興味のある蛋白の遺伝子座にHA-tagを挿入し、このTagを使って蛋白の発現を確認したいということなんですよね？ はい、強制発現ではなく、293T細胞のある遺伝子にHA3タグを持たせています。 > で、普通に考えてHA-tagを入れても発現量が変わるわけではないだろうし、 感度を上げる目的でHA3タグにしていますので、理論的には検出はあがるはずです。 > と言われても、いや、それ単なるノンスペじゃないの？と思うのはおかしくないと思います。 当然コントロールのノックインしていない293Tを隣に並べてのウエスタンなのでノンスペを疑ってはいません。もちろんオフターゲットによる別の遺伝子にHA3タグが入ったのをみている可能性は当然ありますので、そういう意味でおっしゃられるノンスペだとしたら可能性は排除はできませんね。 文面から察するに、発現量が低いからSensitivityの高いECL Kitを使い長い時間露光してやっと見えるようなバンドなんでしょう？そういう風にすればノンスペなんてそこら中に出るわけで、サイズが似通っていても、それがあなたの分子の発現を反映していると自信を持っていえる根拠にはならないように思えます。 上記の通りです。 > 1) トピ主さんのタンパクに対する抗体はものすごく感度が低いことが知られているとか、なにかHA-tagを使った検出系にしなくてはならない理由があるのでしょうか？ そのタンパク質に対する抗体は感度が悪いのか、それとも発現量が極めて低いものなのかはわかりませんが、後者の可能性は高いと思っています。そのためHA3タグを挿入することで感度を高め、また、良質なHA抗体でエンドのものを検出しようという考えです。 > 2) 「6% SDS-PAGEにまでacrylamideを下げてようやくノンスペと分離できるか」ギリギリであっても、分離が出来ているならばそれで良いのでは？ おっしゃる通りです。 ただ私の分子はプロフォームからプロセシングを受けるので、130kDのノンスペバンドは無くしたいという理由があります。 ＞念の為に聞きますが、その6% SDS-PAGEで作ったメンブレンにHA抗体を使ったとき、parental 293Tでは110kDaのバンドが出ず、HA-tagを入れた293Tでは（薄いけれど）バンドが見られるんですよね？そういう図が既にあるのであれば、130kDaのノンスペがあろうと別に気にせずにいれば良いと思うのですが。 はい、コントロール細胞では110kDのバンドはありません。プロフォームは130kDなので、ノンスペが邪魔になっています。 み様、エンドトキシン様、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8723-18 - 2020/03/19 (木) 09:13:33 - HA抗体 み様 > 混乱を招くというか皆さんターゲットも130kDaだからノンスペと完全にかぶって検出できないことが問題だと思っていたはず。 > 110と130なら問題ないですね。実際に分離できて特異的なバンドが検出されているようなので。 > 僕の頭の中では完全に消化されました。 すみません、私の書き方が悪かったですね。 > それが常套手段ですし、何度も言うようだけど、さらにIPすればおそらく110が回収されて130はIPフラクションには出ない可能性が高い。 目的はウエスタンをして、ノックイン体を取ること。（スクリーニング） その後、免疫染色で内在性タンパク質の局在を見ること、ですので、免疫沈降はする予定はありません。

(無題) 削除/引用 No.8723-17 - 2020/03/19 (木) 08:04:53 - エンドトキシン >私の分子は内在性の発現レベルが検出限界以下の膜タンパク質です。 >膜分画をとってウエスタンをしてもみえません。 これは、あなたの分子に対する抗体が存在していて、しかしその抗体でWBをしても検出できないということですよね？ >そこでCrispr-Cas9で正確にその遺伝子座へタグをノックインしたものを293Tで作製しました。 確認したいのですが、トピ主さんの実験は、強制発現（pcDNAなんかに興味のある蛋白のCDSをHA-tag配列と共に組み込んで、発現ベクターを作り、これを293細胞にTransfection）の系じゃないんですよね？興味のある蛋白の遺伝子座にHA-tagを挿入し、このTagを使って蛋白の発現を確認したいということなんですよね？ で、普通に考えてHA-tagを入れても発現量が変わるわけではないだろうし、 >HA融合の内在性タンパク質がウエスタンで見える以上、「発現」しているということになります と言われても、いや、それ単なるノンスペじゃないの？と思うのはおかしくないと思います。文面から察するに、発現量が低いからSensitivityの高いECL Kitを使い長い時間露光してやっと見えるようなバンドなんでしょう？そういう風にすればノンスペなんてそこら中に出るわけで、サイズが似通っていても、それがあなたの分子の発現を反映していると自信を持っていえる根拠にはならないように思えます。 1) トピ主さんのタンパクに対する抗体はものすごく感度が低いことが知られているとか、なにかHA-tagを使った検出系にしなくてはならない理由があるのでしょうか？ 2) 「6% SDS-PAGEにまでacrylamideを下げてようやくノンスペと分離できるか」ギリギリであっても、分離が出来ているならばそれで良いのでは？念の為に聞きますが、その6% SDS-PAGEで作ったメンブレンにHA抗体を使ったとき、parental 293Tでは110kDaのバンドが出ず、HA-tagを入れた293Tでは（薄いけれど）バンドが見られるんですよね？そういう図が既にあるのであれば、130kDaのノンスペがあろうと別に気にせずにいれば良いと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.8723-16 - 2020/03/19 (木) 07:53:19 - み > 膜分画にも内在性タンパク質は見えませんでした。 > 膜分画の回収はゴルジ体酵素の精製のためにルーチンに行っていますので、問題はありません。 ここも誤解を招く。 内在発現は標的タンパクに対する抗体を用いた場合、その抗体の質が悪く検出できていない。 しかしHAタグ挿入細胞を作製すると今回問題にしているCSTのHA抗体では検出され、293Tの内在発現が確認できたという状況ですね。 130のクロスリアクトを無視すれば何も問題はない。

(無題) 削除/引用 No.8723-15 - 2020/03/19 (木) 07:44:51 - み >[Re:14] HA抗体さんは書きました : > すみません、混乱を招きますので、加筆します。 > > CST社のうさぎモノクロは130 kDaにノンスペバンドがでます。 > 私が作製したHAタグ内在性タンパク質の分子量は110あたりです。 混乱を招くというか皆さんターゲットも130kDaだからノンスペと完全にかぶって検出できないことが問題だと思っていたはず。 110と130なら問題ないですね。実際に分離できて特異的なバンドが検出されているようなので。 僕の頭の中では完全に消化されました。 > 6% SDS-PAGEにまでacrylamideを下げてようやくノンスペと分離できるか、という具合です。 それが常套手段ですし、何度も言うようだけど、さらにIPすればおそらく110が回収されて130はIPフラクションには出ない可能性が高い。

(無題) 削除/引用 No.8723-14 - 2020/03/19 (木) 05:12:48 - HA抗体 すみません、混乱を招きますので、加筆します。 CST社のうさぎモノクロは130 kDaにノンスペバンドがでます。 私が作製したHAタグ内在性タンパク質の分子量は110あたりです。 6% SDS-PAGEにまでacrylamideを下げてようやくノンスペと分離できるか、という具合です。

(無題) 削除/引用 No.8723-13 - 2020/03/19 (木) 05:07:05 - HA抗体 >[Re:12] みさんは書きました : > 極論、293Tでは内在性の発現が殆ど無い遺伝子と考えた方が納得いくかも。 極論ではなく、当然そのように考えています。 > そのような細胞でもmRNAは大概PCR回せば増幅できるから、結局蛋白レベルで検出できないなら虚しいレベルの話に思える。 > 発現しない細胞にタグを挿入して何がやりたいのか不明。 HA融合の内在性タンパク質がウエスタンで見える以上、「発現」しているということになりますが。 > 発現しない細胞にタグを挿入して何がやりたいのか不明。 発現しない細胞なのであれば、そもそもウエスタンでは見えませんよ。 何をおっしゃりたいのか不明ですが、CRISPR-Cas9で内在性のタンパク質の局在をみることを目的としています。 > 膜画分なんか採るより染色するか免疫沈降で濃縮した方がよっぽど検出できる気がする。293Tで蛋白発現している遺伝子ならという前提での話ですが。 それはケースバイケースです。 そもそも免疫沈降に使える抗体も限られていますし、免疫染色よりウエスタンの方が圧倒的に感度は高いです。膜タンパク質で通常のウエスタンで発現が見られない場合、膜分画をとるというのは常套手段です。 > 用いた分画方法でターゲット蛋白が確かに濃縮回収され、さらに問題の非特異130kDaが膜分画には混入しないことを確認されているのかなど疑問も残る。 膜分画にも内在性タンパク質は見えませんでした。 膜分画の回収はゴルジ体酵素の精製のためにルーチンに行っていますので、問題はありません。

(無題) 削除/引用 No.8723-12 - 2020/03/18 (水) 23:21:10 - み 極論、293Tでは内在性の発現が殆ど無い遺伝子と考えた方が納得いくかも。 そのような細胞でもmRNAは大概PCR回せば増幅できるから、結局蛋白レベルで検出できないなら虚しいレベルの話に思える。 発現しない細胞にタグを挿入して何がやりたいのか不明。 膜画分なんか採るより染色するか免疫沈降で濃縮した方がよっぽど検出できる気がする。293Tで蛋白発現している遺伝子ならという前提での話ですが。 用いた分画方法でターゲット蛋白が確かに濃縮回収され、さらに問題の非特異130kDaが膜分画には混入しないことを確認されているのかなど疑問も残る。

(無題) 削除/引用 No.8723-11 - 2020/03/18 (水) 22:05:53 - HA抗体 >あなたの293T強制発現でその薄−−−いバンドで真のシグナルが見えないというのは導入効率や発現効率が非常に悪いコンストラクトなのか腕が悪いと考えた方が良い気がします。 トピ主です。ありがとうございます。 私の分子は内在性の発現レベルが検出限界以下の膜タンパク質です。 膜分画をとってウエスタンをしてもみえません。 そこでCrispr-Cas9で正確にその遺伝子座へタグをノックインしたものを293Tで作製しました。130kDaに非常に強いバンドが、parental 293Tで見られます。

(無題) 削除/引用 No.8723-10 - 2020/03/18 (水) 14:38:34 - み 3F10もC29F4も使用経験あります。 どちらも良い抗体。WB, immunostain, IP全てにworkする。 CSTのHA-Tag (C29F4)は確かに293T Lysateで150kDa辺りに非常に薄−−−いクロスリアクトがあります。強制発現実験レベルでは無視できるレベルです。 あなたの293T強制発現でその薄−−−いバンドで真のシグナルが見えないというのは導入効率や発現効率が非常に悪いコンストラクトなのか腕が悪いと考えた方が良い気がします。 westernでクロスしてもIPや免染では除外できる可能性が高いので取り急ぎ発現・分子量などを確認する分には手持ちのCST抗体でもやりようがある。

(無題) 削除/引用 No.8723-9 - 2020/03/18 (水) 13:38:02 - 野次馬 ノンスペのバンドが目的のサイズに無い抗体を探したいというトピの目的は正当だと思いますが、モノクロでtotal lysateをウエスタンしてクロスするバンドが出るのは別に驚いたり悔しがったりすることじゃないでしょう。隣のラボで動いている抗体で検出できなかったくらいだから、もともと発現量が高くないんでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.8723-8 - 2020/03/17 (火) 19:23:45 - 独り言 16B12クローンに一票 昔から使ってます

(無題) 削除/引用 No.8723-7 - 2020/03/17 (火) 11:00:17 - ｇ CSTに事情を説明すれば、おそらく対応してくれますよ。

(無題) 削除/引用 No.8723-6 - 2020/03/17 (火) 10:35:51 - HA抗体 mp先生、ありがとうございます。 CSTの異なるモノクロですね。私はマウスの抗体で免疫沈降したものを検出したいので、基本的にはマウス以外のものを探していますが、とても参考になりました。ありがとうございます。 ちさ先生、ありがとうございます。 3F10は特に優れているようですね！ しかもラットなので、ぜひ試してみることにします。 大変有益な情報をありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8723-5 - 2020/03/17 (火) 09:55:51 - ちき http://jfly.uni-koeln.de/html/discussion/2004/0402anti_HA_antibody.html 昔、このJflyのディスカッションを見つけて以降、ずっと3F10(旧Roche、今はミリポアシグマ?)を使っています(対象はハエではなく、酵母かヒト細胞ですが)。非常によいです。

(無題) 削除/引用 No.8723-4 - 2020/03/17 (火) 09:49:26 - mp CSTの6E2を愛用しています。70kd付近にノンスペが出ることが、ありますが概ね感度は良好だと思います。

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