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解決しました、ありがとうございました。 削除/引用 No.8748-5 - 2020/04/20 (月) 13:45:45 - MN

tracker様、egeria様 削除/引用 No.8748-4 - 2020/04/09 (木) 15:12:50 - MN お世話になっております。 お礼と返信が遅れて申し訳ありません。 また、お二人度同時に返信するご無礼をお許しください。 リン脂質はクロロホルムで溶解したストック溶液をメタノールで希釈して、96ウェルプレートに添加し固相化しています。 エタノールで希釈している論文もあるのですが、希釈はメタノールかエタノールかどちらが適しているのかありましたら教えてください。 使っているプレートがMaxisoapなのでtracker様が仰る様にあえて低吸着（普通）のプレートで同様の実験を行ってみようかと思います。 lipid overlay assayは仰る様に市販品を購入してやってみました。確かに高額です。。。 ご紹介していただいた文献を参考に自作もありかと思っています。 貴重なご意見、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8748-3 - 2020/04/06 (月) 16:25:01 - egeria 脂質との相互作用を観察する実験では、まずスクリーニングとしてlipid overlay assayが用いられることが多いように思います。PVDFまたはニトロセルロースの膜に脂質をスポットし、ウェスタンと同様に検出します。脂質の希釈系列で定量的評価も可能です。 https://stke.sciencemag.org/content/2002/129/pl6 自分の希望する脂質クラス・量で実験したかったら自作が必要ですが、一般的な脂質を網羅的にスポットしたものは市販されています（ただし高価）。 https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/00350009.asp?entry_id=1600 リポソームとの共沈で評価する方法が一番信頼できると思いますが、煩雑ですので、どういう種類の脂質とどの程度の強さで相互作用するかをlipid overlay assayで絞り込んでからリポソームで確認するのがよいと思います。結合する脂質クラスが既知であればリポソームが無難です。

(無題) 削除/引用 No.8748-2 - 2020/04/03 (金) 22:02:55 - tracker 1.超遠心によりそのリン脂質を含むリポソームとキナーゼを共沈させる 2.キナーゼを固相化し、そのリン脂質を含むリポソーム(biotin標識リン脂質を混ぜておく)を液相で反応させてavidin-HRPで検出 3.固相化リン脂質量を減らす、あるいは、特定のリン脂質クラスを認識するのであれば、PCなどを混ぜて固相化する 4.固相化プレートがmaxisorpなどELISA用のタンパク吸着性が高いものを使っているなら、あえて低タンパク吸着のプレート(IWAKIのassay plateとか)にしてみる 個人的な経験ですが、核酸を固相化したELISAの際に意外と4.がバックグラウンドを効果的に下げられたのでオススメです。

リン脂質へのキナーゼ結合性評価 削除/引用 No.8748-1 - 2020/04/03 (金) 15:17:31 - MN いつも大変お世話になっております。 リン脂質に結合するキナーゼ(タンパク）の結合性評価を行いたいと思っております。 試しにリン脂質を96ウェルの固相にし、キナーゼを添加し、抗体で検出しました。 （キナーゼにはタグが付いており、抗体+HRPとTMBで検出しました） 通常の結合性評価は行えるのですが、今回、熱安定性を調べたいとも思い、同様の方法で行ったのですが、熱変性させたキナーゼでも固相に結合してしまいました。 固相にリン脂質を用いるのは良くないのでしょうか。 もしくはこのような非特異的吸着が起こらないようにする方法がございましたら、何卒ご教授ください。 なるべくコストを抑えたいので抗体でのサンドイッチ法は避けたく、試行錯誤しております。 このようなリン脂質とキナーゼの結合評価を行う良い方法をご存じでしたら、是非教えて頂きたく、書き込みました。 お忙しいところ恐縮ですが、お知恵をお貸しください。 宜しくお願い致します。

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