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(無題) 削除/引用 No.8830-6 - 2020/05/08 (金) 15:10:23 - カートン箱 >同じサンプルと同じ水を使って別の人と一緒にPCRをしても泳動すると私だけ水のレーンが真っ白になります。 ↑から、手やピペッターからのコンタミのような気もします。 別の人に、あなたが使用している器具を使ってPCRしてもらうとどうでしょうか？ スメアがでるようなら器具が汚染されています。 また、PCRキットは共用か専用か、どちらの形態で使っていますか？ 専用で使っているなら、あなたの使っているキットを別の人にその人の器具でPCR掛けてもらって結果を見るのも必要かと。

(無題) 削除/引用 No.8830-5 - 2020/05/08 (金) 14:53:58 - もか seventhさん、ご教授ありがとうございます。 言葉足らずですみません。 本来バンドも何も出ないはずのネガコンの水のレーンが上から下まで真っ白になるので困っています。 同じサンプルと同じ水を使って別の人と一緒にPCRをしても泳動すると私だけ水のレーンが真っ白になります。 〉遺伝子導入していない親系統由来のDNAでもバンドがでるならプライマーの設計が悪いだけでは こちらも考えておきます。

(無題) 削除/引用 No.8830-4 - 2020/05/08 (金) 14:19:11 - seventh スメアといっても高分子領域とかx-ybpあたりとかで状況が変わるのでもう少し正確に伝えてください。特定の位置にバンドにきっちりバンドが出る場合はスメアとは言わないです。 遺伝子導入していない親系統由来のDNAでもバンドがでるならプライマーの設計が悪いだけでは

(無題) 削除/引用 No.8830-3 - 2020/05/08 (金) 13:12:46 - もか おおさん、ご教授ありがとうございます。 目的はシロイヌナズナにプラスミドDNAが組み込まれているかの確認です。 テストするサンプルでプラスミドDNAのバンドが出たらいいのですがネガコンである水のレーンが濁ったりバンドが出ます。 バンドはきちんと出ているようですがネガコンが比較にならない状況でデータになりません。 ポジコンは蛍光遺伝子を組み込んだプラスミドDNAです。 プラスミドDNAを組み込まれていないネガコンの野生株のシロイヌナズナもポジコンの場所にバンドが出ています。 最後に実験を行った時の温度とサイクル数です。 94℃　2min 98℃　10sec 65℃ 30sec 68℃ 1min 4℃ サイクルはもともと40サイクルでこの時25サイクルに減らしたこともありますが水がスメアになることに変わりはなかったです。

(無題) 削除/引用 No.8830-2 - 2020/05/08 (金) 12:36:40 - おお スクリーニングといいますが何を期待しているのかよくわかりませんが、テストするサンプルでバンドが出たらいいということではないのでしょうか？ プライマーが部分的にアニーリングしたりして非特異的な伸長反応が蓄積してノンスペができてしまっているのかなと思えます。少し厳しいPCRの条件を探って見るのも手だと思います。サイクル数が下げれるなら下げるのも一つの手です。ポジコンはありますか？

PCR後の泳動でネガコンの水がスメアになる 削除/引用 No.8830-1 - 2020/05/08 (金) 11:16:17 - もか 初心者です。初めてトピックをトピックを立てさせていただきます。 プラスミドDNAで蛍光遺伝子を導入したシロイヌナズナの葉から簡易抽出でDNAを抽出してPCRを用いて遺伝子のスクリーニングをしているのですがうまくいきません。 DNAは簡易抽出できてると思うのですが、ネガコンの水のレーンが電気泳動した後に見たらスメアになってしまいます。 （スメアという表現が正しいかはわかりませんね。本来泳動後に見られるべきでないもののことです） 同じ水を使って別の人と同時に実験したこともあるのですが私だけ水のレーンがスメアになったこともありました。 どうすれば水がスメアにならないのか相談いたします。 PCRのキットはGo Taqを使っています。 ご教授よろしくお願いいたします。

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