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(無題) 削除/引用 No.8868-12 - 2020/05/23 (土) 21:32:48 - qq cdfrtvさん、鋭い考察。

(無題) 削除/引用 No.8868-11 - 2020/05/23 (土) 17:02:32 - cdfrtv 細胞剥がす時のトリプシンてあれほんとはトリプシンだけじゃないと思うんだが違うか？まあどうでもいいか。て言うか、『"#$%&&ですよ。』とか『！”＃＄％しますよ。』の『よ。』のところがなんかすごく嫌なんだが。『よ』がでてくると大抵、喧嘩モードか説教モードONになる、ここは。

(無題) 削除/引用 No.8868-10 - 2020/05/23 (土) 10:19:51 - 774R >774Rさんは膜タンパク質が一回貫通だけを想定されていますが、そんなことはないですよ。 何回膜貫通タンパクだろうが事情は変わりませんよ。エピトープのN末側とC末側の両方が膜貫通してた場合でも、エピトープの細胞膜側に切断部位がないとエピトープは細胞から遊離しませんので。 >私は、消失しないと読み取れますが。消失しない根拠をお示しできますか？とお聞きしていますが。 'そこまで執拗にトリプシン処理をし、尚且つ、当該タンパク質が上記の条件を満たしてる場合ってどれだけあるでしょう' という時点でご自身で消失する可能性を示唆されているじゃないですか。 むきになってるか知りませんが、科学に携わるものであれば可能性をゼロと断言はできないことはご承知おきしてくださいね。 つまり、トリプシンで切られてもエピトープが細胞膜上に残るタンパク質は珍しくもなんともないし、細胞を剥がす条件ではそこまで完全消化はしないってことですよ。可能性ですか？　ゼロではないが、コチラの答えとしては、相変わらず「トリプシンで膜タンパク質が消失するとでも思ったか？」です。 言葉を変えて再度質問するが、当該のタンパク質のエピトープの細胞質側に切られる配列があって、立体構造上そこが切られるとタンパク質内の相互作用がないために遊離するということが分かっており、トリプシンの消化速度から計算して完全消化するほどと考えることが妥当なのか？　ということデス

(無題) 削除/引用 No.8868-8 - 2020/05/23 (土) 10:05:04 - とりりん qqさん お見事です。

(無題) 削除/引用 No.8868-7 - 2020/05/23 (土) 08:52:23 - 774R １．トリプシンで切れる配列がFACSで用いる抗体のエピトープより細胞膜側に存在する。 ２．その配列がタンパク質表面にあり、トリプシンがアクセス可能である。 ３．100%とまではいかなくても、上記の切断が十分に行われ、検出感度以下になるまで十分な時間トリプシン処理をする。 ４．膜タンパク質が切断された場合、切られた断片同士の相互作用が失われ切り離される必要がある。（往々にしてニックが入るだけで立体構造は保たれるケースがある。） 細胞をディッシュから剥がすときに、そこまで執拗にトリプシン処理をし、尚且つ、当該タンパク質が上記の条件を満たしてる場合ってどれだけあるでしょう？ トリプシンで膜タンパク質が消失するとでも思ったか？

(無題) 削除/引用 No.8868-6 - 2020/05/23 (土) 07:59:46 - qq トリプシンは少なくともArg/Lys以外では切断しないのだから、発現させる膜タンパクの細胞外ドメインの配列に依存するんじゃない？

(無題) 削除/引用 No.8868-5 - 2020/05/23 (土) 06:52:00 - とりりん dcfrtvさん ありがとうございます。 ケースバイケースになりますよね。 コス7はキレーターでは剥がれないほど強固に接着するのでトリプシンに頼ってしまいますね。 その他の酵素も必要なら試そうと思います。

(無題) 削除/引用 No.8868-4 - 2020/05/23 (土) 06:49:07 - とりりん 774Rさん ＞トリプシンで膜タンパク質が消失するとでも思ったか？ 匿名の掲示板だからといって横暴な書き方は生き方を損しますよ。 実際に何かのタンパク質は消失するんじゃないですか。 消失しないと読み取れますが。消失しない根拠をお示しできますか？

(無題) 削除/引用 No.8868-3 - 2020/05/23 (土) 04:59:47 - dcfrtv トリプシン入れた瞬間に全てが変わるわけでなくて、時間と濃度依存的に反応は進行すると思うので加減の問題なのではないかと思います、やり過ぎれば壊れていくし、見たいものまで壊れる前にいい感じのところで止めれば大丈夫だし（この条件とかロットとかは再現性ある実験する上で重要なので些細なことでも記録しておきましょう）、糖鎖とか邪魔なものもあるので、それでproteinase sensitive なものもresistantなものもあると思うし、Trypsinって、なんか口で言うほど大したことないなとか、やっぱりCOS7は最強だなとか、どうやら俺はTrypsinに勝ったようだなとか、もし思っていたらとそれはあれを甘く見過ぎてて、あれはやっぱり油断ならない相手なので気をつけて使いましょう。

(無題) 削除/引用 No.8868-2 - 2020/05/23 (土) 04:53:56 - 774R トリプシンで膜タンパク質が消失するとでも思ったか？

ファックス実験でトリプシン 削除/引用 No.8868-1 - 2020/05/23 (土) 03:35:27 - とりりん コス7細胞に膜タンパクを過剰発現させてファックスしたいのですが、なんだかんだいってトリプシンで剥がしてもきちんとモノは検出できました。膜タンパクの抗体検出はトリプシン禁忌ではないんですかね？

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