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抗体自作 削除/引用 No.9126-17 - 2020/09/12 (土) 20:38:43 - nak xcfyさま なるほど、ありがとうございます。 確かに、無いなら作る、ということはありかもしれませんね。考えてもみませんでした。 こちらも検討してみます！

(無題) 削除/引用 No.9126-16 - 2020/09/11 (金) 13:04:37 - xcfy この研究の中で今後も長く使う重要なツールであるならば、外部委託で抗体を作成することも考えていいと思う。ディスカウントキャンペーンなどもあるし、使えない高め目の抗体を２、３回買ったと思えば安いと思う。昔よりは価格も下がってきてる。委託先の専門家に使用用途を相談して、それに適した部位で抗原ペプチドを作成してくれるし、そのあたりの実績やノウハウを保有してるはずだから。使える市販品がほとんどないならば、いい抗体ができれば、リクエストも来るだろうし、文献引用の増加や共同研究のきっかけとかにもつながる。

xcfyさま 削除/引用 No.9126-15 - 2020/09/11 (金) 06:07:12 - nak コメントありがとうございます。 100％同意です。 しかし、代用品となる抗体が現時点では存在しないのです。。。

(無題) 削除/引用 No.9126-14 - 2020/09/10 (木) 23:41:07 - xcfy 経験的なことを総合すると、IPあるいはWBでどうもうまくいかない抗体は、、どうやっつてもほぼ無理。逆に使える抗体は、かなりいい加減なことやっても、ちゃんと出ます。なので複数の論文や情報を精査して抗体を選び直すのが一番早道です。抗原と抗体の反応には私たちの洞察の及ばないようなものがあると思います。IPの場合抗体と抗原の親和性の強さも一定以上のレベルが必要と聞くし。多分ガチで取り組めば何が原因か突き止められるのでしょうが、皆さん一つの市販抗体のためにそこまで時間と労力をかける人もなかなかいないので。

お返事が遅くなりました 削除/引用 No.9126-13 - 2020/09/10 (木) 03:47:14 - nak お返事が遅くなりました。申し訳ありません。 たくさんの勉強になるコメントありがとうございます。 > おお様 抗体がデタージェントに負けている可能性を考えてみるということですね。 確かにそれはまだやっていないので、塩による抽出も試してみようと思います。 あと、ご指摘のCell lineですが、実はポジティブコントロールとなるような細胞とタンパクが未知であり、どのcell lineが最も有効なのかははっきりしないのですが、最近いくつかのcell lineは試みてみております。上手くいきそうならそちらからのアプローチも検討中です。 ELISAはやってみたのですが、細胞抽出タンパクに限らず、どうも上手くWorkしませんでした。 あと、抗体にクロスリンカーを作用して釣り上げてくるというのはとても面白いですね。PFA以外での固定はまだやっていないので、こちらも検討してみます。 どんどん方法を提案してくださって、この実験が上手くいかなくても勉強になって、凄く得した気分です（笑）。 ありがとうございます。 > WB様 そうですね、能書き上は数アミノ酸程度のものを認識しているとされる抗体ではあり、立体構造依存的ではないはずですが、今回相手にしている細胞内のタンパクについては立体構造依存的な反応をしている可能性はありますよね。 ただ、それだと免疫沈降では沈降できてくるような気がするのですが、どうでしょうか。免疫沈降するときの溶媒を変えてみるなどで変化する可能性もあるかもしれませんね。ちょっと、ただでさえ可溶性がどうなのか、という状況なのでbuffer exchangeは若干怖い気もしますが、トライしてみます。

(無題) 削除/引用 No.9126-12 - 2020/09/02 (水) 17:52:38 - おお >[Re:11] WBさんは書きました : > 抗体が、構造を認識している場合があります。その場合は、変性下のWBではうまくいかないかもしれません。未還元のSDS-PAGE、もしくはnative-PAGEを試されてはどうですか。 リコンビナントをつかったWBでワークするとおっしゃっているので、、、 このときの結果から検出感度は見積もれないのかな。 少し発想を転換して、IFでワークしているわけですよね。固定をアルコールや酢酸などを使っても検出できるでしょうか？ もしそうなら固定した細胞をIFの要領で一次抗体を結合させます。その後還元剤で切断できる（分子内にS-S結合をもっている）クロスリンカーで抗体とターゲット分子を架橋します。固定した細胞の蛋白をRIPAなど非変性だけどそこそこ強いバッファーで溶出します。その後Protein A/Gビーズで抗体を回収します。ターゲットの蛋白はクロスリンクを還元剤で外して回収します。 もし固定したサンプルが十分に可溶化できないなら変性条件で溶出し、Anti-IgGなどでプルダウンすればもくてきの蛋白が結合した抗体が回収できるでしょう。 未固定で抗体で染めれるなら更にやりやすいです。PFAで固定しないと染まらないなら、抗体ー蛋白のクロスリンクプロダクトを得るのにちょっと工夫を加えないと行けないですねぇ、、、プロテアーゼで限定分解とか、、、どこまでうまくいくかわかりませんけど、理論上ワークしそうな系はデザインできそうな気がします。もう少しねってから書き込めれば書きます。 このようなやり方はトリッキーだと思いますし、どのようにワークしているかを確認するかという問題はあるでしょうけど、そこさえ納得が行くような状況ならターゲットの蛋白は（またはそのフラグメント）は同定できるでしょう。

未変性 削除/引用 No.9126-11 - 2020/09/02 (水) 10:57:49 - WB 抗体が、構造を認識している場合があります。その場合は、変性下のWBではうまくいかないかもしれません。未還元のSDS-PAGE、もしくはnative-PAGEを試されてはどうですか。 似たような、経験があります。

(無題) 削除/引用 No.9126-10 - 2020/09/02 (水) 08:46:15 - おお 膜タンパクでないなら（免疫染色でそう判断できるなら）、単に塩で抽出してもいいかもしれません。よく核蛋白を抽出するのに３００mMのぐらいの塩を使います（ナトリウムかポタシウム）。 ポタシウムはSDSと相性がわるいのでナトリウムでいいと思いますが、細胞のペレットの３から５倍くらいの３００mM NaClと２ mM MgClを含むバッファーで懸濁して何らかのしょりで細胞を破砕して、遠心して上清を使う手があります。細胞破砕は弱い超音波とか、小さいグラスビーズを少し加えてボルテックスするとか、ニードルを数回通すとかやり方はそれなりにあります。 この程度の塩濃度は核から蛋白を抽出するときに使われるので核マトリクスやクロマチンは残りますが、殆どの各蛋白が抽出されていると考えられていて、ゲルシフトアッセイのマテリアルとして使われたり、スプライシングや転写反応の実験で使われたりします。気になるなら遠心で除いたあとの蛋白も保存しておいてそちらに目的の蛋白が行っているか見てみるといいかもしれません デタージェントフリーでかなりのSolubleな蛋白が取れるので抗体がデタージェントに弱いようなら使ってみてもいいのではないかと思いました。 あとメーカーがWB使用可能としているようですが、メーカーにそのデーターや方法を聞いてみてもいいかもしれません。 細胞はヒト末梢血好中球ということでいろいろと制約があるようですが、扱いやすいCell lineでその修飾が施されるとわかっている蛋白をタグ付きなどで発現させたりして、条件を模索してからヒト末梢血好中球を使うほうが、闇雲にアレコレするよりも方法を模索しやすいように思いますがどうでしょうか？ その抗体ELISAでワークしますか？もしそうなら違う方法論も考えてもいいかもです。

おお様 削除/引用 No.9126-9 - 2020/09/02 (水) 04:49:34 - nak ありがとうございます。 実は現時点で修飾を受けているタンパクが何なのか、わからないのです。 どのタンパクが修飾を受けるかということを知らんがためにWBやIPをするという目的もありまして、、、 すみません、もっと詳細に状況を最初に記しておくべきでした。

(無題) 削除/引用 No.9126-8 - 2020/09/02 (水) 03:11:30 - おお 事情はわかりました。一つの方法論として、修飾に関係なく反応する抗体でIPしてその修飾特異的抗体でWBというのは考えたのでしょうか？

ありがとうございます 削除/引用 No.9126-7 - 2020/09/01 (火) 20:22:25 - nak 皆様ご教授本当にありがとうございます。 > おおさま これはLysateでWorkするという論文報告ではなくて、単に、実験として動く、というメーカーのデータシート情報です。紛らわしい表現をして申し訳ありません。 ちなみに、FACSによる定量はまさに今試みておりまして、予備実験では上手くいきそうな手ごたえを得ています。 核タンパクの抽出は試みたのですが、上手くいきませんでした。 というのも、これも中途半端に隠したため混乱を招いたかもしれませんが（申し訳ありません）、細胞はヒト末梢血好中球で、タンパクは発現そのものを見ているのではなく、翻訳後修飾されたものの量、というか翻訳後修飾の強さを見ています。 刺激を入れると好中球細胞外トラップを起こし始めて細胞膜や核膜に穴が開いていくため、核タンパクの抽出がどうも上手くいきません。浸透圧で溶血させる核タンパク抽出キットで試しただけなので、超遠心とかならいけるかもしれませんが。 そしてこういう環境なので、タグを仕込むなどの手法が使えないのです。。。 > みさま WBそのものの条件検討はかなり行いまして、最高50ugほどロードしたり、バッファーや検出試薬を変えるなど、いろいろと試みてみてはいます。 あとはやはりそうですよね、ご指摘の通り、IFで見えることから期待するほどにはタンパクの量が多くなくて、濃度が低いという可能性ですよね。 濃縮後のIPというのは一度やってみようと思います。 なお、特異性については上記のように直接ノックダウンはできませんから、ノックアウトマウスを使うなどして検討してみます。 > dftyuさま ありがとうございます。 ペレットをサンプルバッファーで溶かしてみるというのは確かにありですね。考えていませんでした。早速やってみます。

(無題) 削除/引用 No.9126-6 - 2020/09/01 (火) 19:41:03 - dftyu RIPAのタンパク質可溶化能は、その名前からもわかるようにそれほど高くはないと思うのですが、分析対象とするタンパク質はRIPA bufferで可溶化、抽出はできるのでしょうか。ていうか、現状WBで見えてないので、その判断も難しいと思いますので、今度、RIPA bufferでタンパク質を抽出可溶化後に遠心した沈殿（RIPA 不溶性画分）をなるべく少量のSDS-Sample bufferに溶かして（粘性が強ければ10μlチップをつけたマイクロピペットで出し入れしてください。)RIPA可溶、RIPA不溶が分子￥それぞれでwestern blotをしてみてください。あと培養細胞からえらっるタンパク 当たり前ですが、IPもWBもとりあえず、みたいものがきちんと抽出されて試料中に溶けていることが前提になりますので、ここに???があると先に進めないので。

(無題) 削除/引用 No.9126-5 - 2020/09/01 (火) 08:38:10 - み >[Re:1] nakさんは書きました : > ちなみに、この抗体はIF、WB、IPいずれでもworkすることが報告されています。実際、自分でin vitroで用意したタンパクを用いてやってみた場合、WBでもIPでもworkしています。 > 内在性は少ないだろうから検出しにくい。 本当にIPできる抗体なら500ug-1000ugのタンパクをIPして濃縮してからWBすれば検出できるだろうけど、それも駄目なら抗体特異性・反応性に疑いが残る。 IFのシグナルもノックダウンなどで検証しないとね。 > 溶出不良である可能性も考え、1x10^6 cellにつき10uLから100uLまでのRIPA bufferで試してみましたが結果は変わりません。総蛋白濃度はおおむね1-5mg/mL程度になります。 濃度書かれても何マイクログラムロードしたのやら。 WBの検出時も感度の良い試薬を使うとか工夫はできるだろう。

(無題) 削除/引用 No.9126-4 - 2020/09/01 (火) 08:32:59 - おお >[Re:1] nakさんは書きました : > 同様の内容は既出かもしれませんが、ご指導ください。 > ちなみに、この抗体はIF、WB、IPいずれでもworkすることが報告されています。 その報告においてはどのようにLysateをつくったのですか？報告主にコンタクトしてみるのも選択肢かと思います。 そめれるならFACSで定量というのもありなのかも。 DNAに結合する可能性を考えているならその蛋白は核内に発現しているのですか？核をとってきて核蛋白を抽出すればどうでしょうか？ タグ付きの哺乳動物用発現ベクターで過剰発現して検出しやすい環境で検出するか、タグでIPしてその抗体でちゃんと検出できているか調べてみるのも手かもしれません。 その蛋白名は開示できますか？

Sさま 削除/引用 No.9126-3 - 2020/09/01 (火) 04:37:06 - nak ご指摘ありがとうございます。 そして、量を間違っていました。正しくは「10uLから1000uL」です。混乱させてしまい、申し訳ありません。 この細胞種においては一応十分な溶出が出来ているものと考えています。 あと、抗体についてですが、辛いことに、抗体は現在のところ1種類しか無いのです。。。 非特異的な結合についてはそうですね、さらに詰めた方が良いかもしれませんね。検討します。

(無題) 削除/引用 No.9126-2 - 2020/09/01 (火) 03:57:59 - S > 1x10^6 cellにつき10uLから100uLまでのRIPA bufferで試してみましたが結果は変わりません。総蛋白濃度はおおむね1-5mg/mL程度になります。 その細胞数に対してそのバッファー量が少なすぎるかと思います。 きちんと可溶化できているか疑問があります。 免疫染色のシグナルは偽陽性という可能性を疑い、ノックアウト細胞やRNAiが実行可能であれば一度その抗体の特異性を見てもいいかもしれません。それ以外の抗体でも試してもいいかもですね。

免疫蛍光染色の結果と、ウエスタンブロットや免疫沈降との乖離 削除/引用 No.9126-1 - 2020/09/01 (火) 02:24:58 - nak 同様の内容は既出かもしれませんが、ご指導ください。 蛍光免疫染色（IF）で、とある細胞内タンパクを染色し、各条件下においてそのタンパクの量がどう変わるかを検討しています。 IFの見た目においてはそれなりの違いが認められ、何かしら意義のあるものを見ていると考えています。ただ、IFからは定量が困難で（画像処理ソフトウェアである程度は可能ですが）、別の方法で定量を試みています。 そこでウエスタンブロット（WB）や免疫沈降（IP）を試みてみているのですが、バンドが認められません。 このようにIFとWBやIPの結果が乖離するとき、何が考えられるのでしょうか。また「これを工夫すればWBやIPでバンドが見られるかもしれないよ」というような、改善点はありますでしょうか。 ちなみに、この抗体はIF、WB、IPいずれでもworkすることが報告されています。実際、自分でin vitroで用意したタンパクを用いてやってみた場合、WBでもIPでもworkしています。 実験の条件は以下の通りです。 IFの細胞内染色は4%PFAで固定後、0.2% Triton-100で透過処理を行って染色しています。主にタンパクは核内に分布しています。Isotype controlとなる抗体を使ったり、二次抗体だけで染色した場合には蛍光は無く、基本的には非特異的結合ではないと考えております。 細胞からのタンパクはRIPA bufferを用いて溶出しております。プロテアーゼ阻害薬カクテルは十分量を添加しています。 溶出不良である可能性も考え、1x10^6 cellにつき10uLから100uLまでのRIPA bufferで試してみましたが結果は変わりません。総蛋白濃度はおおむね1-5mg/mL程度になります。 また、DNAに強く結合することで溶出不良となっている可能性も念頭にDNaseによる処理も行ってみましたが、結果は変わりませんでした。 ちなみに、定量に市販のサンドイッチELISAキットを用いてみましたが、これはキットそのものがあまり良いものではなく、私の細胞由来タンパクがどうこうという以前の問題として、コントロールを用いた検討でも正確な結果が得られませんでした。 定量以外でも、例えばクロスリンカーを用いて相互作用を有する別のタンパクを共沈降してきたい、という今後の目論見もありますので、特にIPはぜひworkさせたいところなのですが、上手くいかずに困っています。 どうかお知恵をお借りできませんでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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