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(無題) 削除/引用 No.9303-10 - 2020/11/17 (火) 09:53:26 - L ＞＞AAさん ありがとうございます。 早速試してみます。

(無題) 削除/引用 No.9303-9 - 2020/11/16 (月) 11:05:39 - AA 組織の凍結についてコメントし忘れました。 普通に摘出した脳をそのままドライアイスアセトンや液体窒素で凍結して、それを直接試料台へくっつけて薄切します。 くっつけるときに少量のコンパウンドを試料台に乗せて糊代わりにしています。

(無題) 削除/引用 No.9303-8 - 2020/11/16 (月) 10:59:18 - L >>AAさん、おおさん ご返信ありがとうございます。 目標とする領域は前交連の後部（両側が繋がる部分から）というほぼ視認できる目標がありますので、機械がぶれない限り、上下にずれることはないかと思います。 ただブレインマトリクスで切れる領域はやはり少し厚いため（刃を通す溝が既に0.3mmの厚みですので）、やはり凍結にして斬ろうかと思います。 ですが確かにお二方のご指摘通り、切りにくい為、40〜50マイクロぐらいで薄く切り、複数のセクションからパンチし、RNAlaterによりOCTを洗うといった方法が良さそうです。 現段階ではqPCRだけの予定なのですが、後々はプロテオームになる可能性があるので、AAさんのご提案も参考にさせて頂きます。 真剣なご回答ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9303-7 - 2020/11/16 (月) 09:51:00 - AA >>この厚みで３００マイクロで切ったら上下どちらかにずれたら他の領域を含んでしまいそう 私も同じことを思いました。300umの領域を集めてくるのに300umの厚みの切片を使うと、常に切片の中心に領域の中心を捉えないといけません。実際には無染色のサンプルから正確に300umを捉えるのはまず無理だと思います。 それよりはもっと薄い切片を複数枚作ってそこから回収してくるほうが良さそうですし、LMDが有るならLMDで良いのではないでしょうか。 着色工程も含むのでLMDなら正確に目的領域だけを回収できると思います。 とはいえ、LMDもフィルムスライドなどの消耗品が必要になりますし、あとに続く実験次第ですが、RNAseqに外注するなどの大コストの実験ではないなら私ならまずはブレインマトリクスではじめます。

(無題) 削除/引用 No.9303-6 - 2020/11/14 (土) 02:12:46 - おお >[Re:5] Lさんは書きました : > >>AAさん > > ご返信ありがとうございます。 > > まさにご指摘の通りで、欲しい領域がちょうど3〜400umの厚みで存在しており、余分にとってしまうと他の領域と混在してしまいます。 この厚みで３００マイクロで切ったら上下どちらかにずれたら他の領域を含んでしまいそうですが。 それよりも40umできって複数の切片から必要な部分をマイクロパンチャーでパンチングしたほうが良くないですか。 ＞2、何とか切れた0.3�oの凍結切片を融解した際、RNAnase freeの水に浮かべても大丈夫なのでしょうか？ 硫酸アンモニウムがRNase阻害剤になっているので水で希釈されてしまうと内在性のRNaseの活性化は確かに懸念材料です。

(無題) 削除/引用 No.9303-5 - 2020/11/13 (金) 19:41:39 - L >>AAさん ご返信ありがとうございます。 まさにご指摘の通りで、欲しい領域がちょうど3〜400umの厚みで存在しており、余分にとってしまうと他の領域と混在してしまいます。 レーザーダイセクションの機器は当校にあるのですが、それでは逆に厚いサンプルは切れないので、やはりAAさんがご提示されたビブラトームが最適かと思われます。（ないのが非常に残念なのですが） ですが、周囲のOCTを減らすという手は考えておりませんでした。 この場合、組織の凍結はどういった手法を使われるのでしょうか？ それとも事前に常温のメスなどで余分なOCTを切り落とすのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9303-4 - 2020/11/13 (金) 15:53:30 - AA 一定の薄さの切片が必要であれば何らかの機械が必要になりますね。 ちなみに、レーザーダイセクションなどのサンプルを切片化するときにはコンパウンドには埋めません。 クライオスタットの試料台への接着のために少量は使用しますが、薄切する際の組織周囲にはコンパウンドがない状態で切ります。 レーザーで焼ききれる程度の薄さで切るので一概に比較できませんが、コンパウンドの塊ではなくてその中の脳だけであれば刃に当たる抵抗も小さくなってもう少し切りやすいかもしれません。 コンパウンドをなくしてもカールしてしまうのは避けられませんが、例えばスライドガラス上に回収してパンチャーで切り抜くという手はあるかもしれません。 ちなみに300umの再現性は本当に必要でしょうか？ 1mm x 300um径より大きいと標的と別の領域が含まれる、というのであれば問題ですが、そうでないなら後でRNA量で補正すれば良いように思います。

(無題) 削除/引用 No.9303-3 - 2020/11/13 (金) 14:33:33 - L >>AAさん ご返信ありがとうございます。 ラボにブレインマトリクスはあるのですが、何分の1mmの厚さでしか切れないもので、0.3で切ろうとすると再現性が取れなくなってしまいますし、目標部位まで到達できるかも曖昧になります。 なのでAAさんがご提示されたビブラトームという方法が理想的であるのですが、 （知りませんでした。勉強になります。） しかし調べた所大学にはありませんでした。。。 もうしばし、検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.9303-2 - 2020/11/13 (金) 10:21:17 - AA freshな状態でスライスにしてそこからパンチしてRNA抽出へ回しています。 スライスにする場合は厚くても構わなければブレインマトリクスのような簡便なスライサーを、 もっと薄いほうがいい場合はビブラトームなどのマイクロスライサーを使っています。 とにかく組織片をRNAlaterやTrizolに入れるまでの時間を短くすることに主眼をおいています。 クライオスタットで300umというのはかなり分厚くて刃が負けたりしそうですし機械部分に負荷が高そうですね。 選択肢があるなら他の切り方を検討されてもいいと思います。

凍結切片脳厚切りに関するご質問 削除/引用 No.9303-1 - 2020/11/12 (木) 23:05:30 - L 当方大学院生なのですが、脳に関する実験を行っております。 実験の都合上マウス脳内の一部分を取り出し、RNAを精製する必要があります。（大きさは約１ｍｍ＊０.３ｍｍの円柱状） 限りなく小さいので、精確に採取するため： １、RNAlaterで脳ごと処理 ２、OCTで凍結ブロックを作成（ドライアイス＋ヘキサン）し、−80度 ３、−30度で1時間置き、ミクロトームで目標の部位までトリミング ４、0.3�oの厚みで“厚切”を採取 ５、マイクロパンチャーで一部をパンチング ６、TRIzolで精製 の流れで試しております。 （先行研究でこのような方法があったのですが、アバウトな記述でした） ですが、2点ほど問題が存在します。 １、0.3�oの厚みで切る際、非常に切りにくく、カーリングが酷い、そして均一に切れない （はじめと終わりのOCTのみの部分で必ず止まり、力を入れないと前に進めない；10〜40μｍの厚みであれはテーピングを使用することで必ず綺麗に切れる） ミクロトームの条件→CT：−20℃、OT：−15℃、室温24℃ 2、何とか切れた0.3�oの凍結切片を融解した際、RNAnase freeの水に浮かべても大丈夫なのでしょうか？RNAlaterで脱水して安定させているので、浮かべるのは膨張と内因性のRNAnaseが働くかで少し怖いです。 もしも似たような実験を行っており、経験がおありの先生がおりましたら、ご指導いただければ幸いです。

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