全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.973-18 - 2012/09/30 (日) 12:08:16 - Postdoc 2 いろいろな方と議論することで自分の考えが次第に整理されてきました。大変有意義な議論でした。あとは実践あるのみですね。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.973-17 - 2012/09/30 (日) 11:56:22 - grad freeze-thawいいと思います。私も良く読んでいませんでしたが、Application Sheet C02にfreeze-thawに関するデータもありましたね。

(無題) 削除/引用 No.973-16 - 2012/09/30 (日) 07:31:59 - Posdoc 2 > gradient formerでも、あっという間にできあがりというわけではないですし。 おっしゃる通りですね。 実は、AP様と同じような考えに至り、非連続密度勾配液を作って縦置きのままで凍結し保存しておき、必要となった時に融解したらいいのではないかと考えて検索していたところ以下のようなものを見つけました。 ソース http://www.bio.net/bionet/mm/methods/2000-September/084911.html 一部抜粋 ------------------------------------------------------------- For a relatively low density (e.g. 5-20%) gradient, fill the tube (or a rack of tubes) with the intermediate concentration (e.g. 12.5%) sucrose in the appropriate buffer, freeze in a -20 freezer, thaw at +4, and repeat 2 more times. Gradients can be stored at the last freeze for quite a long time and thawed as necessary. For higher density gradients (e.g. 15-65%), you can start by layering an equal volume of the less dense (15%) on the more dense solution, then proceed as above. This procedure works very well for 4-5 ml gradients. for larger ones, you may have to experiment a bit. This method has saved us a lot of work over the years. -------------------------------------------------------------------- 上にあるように非連続勾配液をつくってしばらく置いて連続勾配に近づけてから凍結するほうが、AP様がおっしゃるような層ごとに凍結する方法よりも簡単かなと一瞬思ったのですが、後者のほうが再現性の低下を防ぐという意味ではいいんですかね。ただそれだと冷凍庫から出してから、きちんとした連続勾配が形成されるまでにやや時間がかかりますよね。そこは凍結融解を繰り返せばいいのでしょうが。まぁ、いずれの方法にしろ目的とする密度勾配ができるような条件さえ分かれば、後はたくさん作りおきしとけばいいから楽ですね。 以上のように考察しましたが、他に御意見、付け足す点などありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.973-12 - 2012/09/30 (日) 07:29:19 - ano GE社（ファルマシアの時代ですが）のGradient Makerは、泳動用のゲルを作るのに使っている所を見たことがあります。多少は、ばらつきが生じるらしいです。そのためステップワイズでも良いと思います。 Gradient Makerの実物を見ると、販売値段が高すぎる事がよく分かります。 昔の研究者は、自分でアクリル細工やガラス細工をして色々な装置を作ったものです。自分で作れなくても、ネット等で請負制作をする会社はいくらでもあるので、図面と見本写真を送って作ってもらうという手もあります。

(無題) 削除/引用 No.973-9 - 2012/09/30 (日) 05:52:11 - おお >[Re:6] Postdoc 2さんは書きました : > > 2. 実はマウスの臓器だけでなく、将来的には移植術後のレシピエントの臓器を使う事を予定しています。移植術はドナーがでたらすぐに始まるので前もって準備ができず、また他の作業を並行して行うことも考えると、どうしても短時間でさっと密度勾配液を作らないといけません。 マウスでどの密度で細胞が得られるかを検討して、臨床材料はステップワイズで精製するというのもてではないでしょうか。ひととマウスの違いもあるので、100%確実とはいえませんが、マウスのデーター参照に少し前後細か目のステップワイズを取っておくと漏れがないようにできるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.973-8 - 2012/09/30 (日) 02:06:58 - AP >どうしても短時間でさっと密度勾配液を作らないといけません。 やったことはなくて、どこかで見た記憶だけなんですけれど、 密度の高い溶液から順に、チューブに入れては凍結させ、次の密度の液を入れて凍結させというのを繰り返してstep gradientを作り、最後の凍結でそのまま凍結保存してしまう方法がありましたね。 また、少なくともショ糖密度勾配の場合は、一定濃度の溶液に対して、Freeze-thawを繰り返すと、融け始めの液の濃度が高く底にたまり、次第により濃度の低い溶液が積み重なっていくことで、濃度勾配を作るという方法があります。 で、言いたいことは、予め密度勾配を作って、凍結保存でストックしておいたらどうでしょうか。融けるのにある程度時間がかかりますが、gradient formerでも、あっという間にできあがりというわけではないですし。

(無題) 削除/引用 No.973-7 - 2012/09/30 (日) 00:42:19 - grad 1.二晩静置について やったことがないので分かりません。申し訳ございません。 2.準備する時間について すでにApplication Sheet C02をご覧になったかと思いますが、連続勾配を形成するためには、チューブを縦において置くことで1晩程度、チューブを横にする事で1時間程度必要となっております。また、私の場合、緩衝液を作成し、チューブに重層し終わるまで１時間程度かかっております。前日に作っておく事で、遠心当日は非常に余裕を持った実験となっています。Postdoc 2様の実験計画に対応できるかどうかは一度密度勾配を作ってみてくださいとしか言えず、申し訳ございません。密度勾配の出来は吸光度を測定することにより確認できるはずです。 密度勾配の出来がそれほど重要になるとは個人的には思っていませんが、手技の差をなくすためにはGradient Makerは役に立つかもしれませんね。他の作業を並行して行うことに役に立つかどうかはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.973-6 - 2012/09/29 (土) 20:28:51 - Postdoc 2 > 私はApplication Sheet C02にあるように重い方からステップワイズに重層していき、４度で一晩程度チューブラックに立てて置いておくのが好きです。拡散によりいい具合に連続勾配になります。装置等は必要ありません。普通に無菌的に操作出来るはずです。 > grad 様 貴重な御意見ありがとうございます。いくつか質問させていただいてもよろしいでしょうか ? 1. １晩おいて連続勾配になった後、その連続勾配はどれくらいの期間維持されるのでしょうか。例えば２晩たってから使うのとかも可能でしょうか? 2. 実はマウスの臓器だけでなく、将来的には移植術後のレシピエントの臓器を使う事を予定しています。移植術はドナーがでたらすぐに始まるので前もって準備ができず、また他の作業を並行して行うことも考えると、どうしても短時間でさっと密度勾配液を作らないといけません。だからこそ2-chamberを使った方法を考えていました。これにつきまして何かアドバイスございましたら教えていただけないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.973-5 - 2012/09/29 (土) 17:11:09 - grad 私はApplication Sheet C02にあるように重い方からステップワイズに重層していき、４度で一晩程度チューブラックに立てて置いておくのが好きです。拡散によりいい具合に連続勾配になります。装置等は必要ありません。普通に無菌的に操作出来るはずです。 www.axis-shield-density-gradient-media.com/Cells/C02.pdf

的確なアドバイスありがとうございます。もう一つだけ質問があります。 削除/引用 No.973-4 - 2012/09/29 (土) 12:27:33 - Postdoc 2 <おお 様　　　　<qq　様 貴重なアドバイスならびにリンクまで貼って頂いてありがとうございます。 自分でいろいろなサイトや報告をみているとGE社のGradient MakerやBio-radのGradient Formerを使ってContinuous Gradientをつくっているというのを多くみかけました(中にはこれらに似せたものを自作したという強者もいました (^^) )。これらならそれほど高くないのでボスもOKしてくれそうです。そこでですが実際にtwo-chamber式のGradient Maker (or Former)、あるいは似たような他社製品を使って仕事をされた経験がある方はいませんでしょうか。使い勝手やお薦めのモデル、ポンプの必要性などについて聞かせていただければ幸いです。それと、今回の実験は細胞の分離とそれに引き続く細胞培養があるのでdensity gradientの制作の段階から可能な限り無菌的にことをすすめたいのですが、その当たりについて経験のある方や経験はなくても御意見をお持ちの方はいませんでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.973-3 - 2012/09/29 (土) 11:13:16 - qq Axis-Shield社のOptiPrepには、大変詳細なマニュアルがメーカーのHPにアップされています。（www.axis-shield-density-gradient-media.com/） じっくり読んでみられるとよろしいです。

(無題) 削除/引用 No.973-2 - 2012/09/29 (土) 09:15:09 - おお http://www.jove.com/video/2698/quantitative-assessment-immune-cells-injured-spinal-cord-tissue-flow あらかじめ遠心して自らの重さでこう配を作る方法 サンプルと混ぜて均一な溶液にしたり、均一な溶液のうえにサンプルを乗せて、遠心し遠心の過程でこう配を作りながらサンプルを分ける方法 バッファーとの混合比により目的の密度の溶液をつくり、重い方から重層していく方法(ステップワイズになる)。 あなたが考える最も重い密度と、最も軽い密度のものを用意して混合比を変えながら混ぜて遠心チューブに注いでくれる機械を使う方法。 いろんな方法があるのでもう少し参照している論文をよむか、詳しく書いてないならリファレンスや関連文献など当たってよく調べてみてください。

密度勾配液の作り方 削除/引用 No.973-1 - 2012/09/29 (土) 08:36:19 - Posdoc 2 今度、組織から酵素的、物理的に取り出した細胞懸濁液から特定の細胞を分離するために密度勾配遠心分離をしようと考えています。Axis-Shield社のOptiPrepが自分の用途に合っているようなので今度購入しようかと考えています。 Protocolによれば1.03g/mlから1.15g/mlの密度勾配をつくるとあるのですが、今まで密度勾配なるものを作ったことが一度もありません。ネットで調べてみましたが、文字による説明ばかりで今ひとつイメージがわきません。どなたか密度勾配の作り方に詳しい方、御教授頂けないでしょうか?　いくつか作り方はあるようですが、なるべくシンプルで再現性のある方法だと助かります。

全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---