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(無題) 削除/引用 No.9738-10 - 2021/06/11 (金) 15:21:24 - AA 私はLMDのときはトルイジンブルーで染色していましたが、トルイジンブルーは水溶液なのでパラフィン切片では使えませんね。 参考までに凍結切片のLMDの場合は、 新鮮サンプルを急速凍結、 薄切してフォイルスライドに貼り付け、 エタノール/酢酸混合固定液で固定、 RNAase free水で洗浄、 染色、 再洗浄、 乾燥させてLMDへ、 と言う流れです。 各ステップでもたついたりするだけで取れるRNAの品質は変わりますが、パラフィンサンプルはそもそも調整にかかる時間が長いのでそれだけ分解を受けやすくなります。 また、ホルマリン固定により核酸がタンパク質などと架橋されることで機械的な力に弱くなり、せん断を受けやすくなることから、FFPEサンプルからのRNA調整は凍結のそれと比べて収量が少ないと考えられています。 一応ライカのLMDのマニュアルなどにはパラフィンサンプルでの作業の紹介もあるので、全く出来ないということはないと思います。 LMDの場合は色がついていないとレーザーによって焼き切るのが難しくなるので サンプリング前に脱パラフィンと染色をしていますが、目視で行うのであれば脱パラフィン前の無染色の状態で作業したほうが良いと思います。 行程を減らすということと、RNAの酵素的分解は加水分解なのでパラフィン状態なら少なくともそれについては考えずに済むからです。 FFPEサンプルからのRNA調整キットはいろいろ売られていますし、その説明のところに注意点もよく記載されているのでウェブページなどを調べてみると勉強になると思います。

(無題) 削除/引用 No.9738-9 - 2021/06/11 (金) 13:04:56 - aaa 諸々踏まえたうえで �@　脱パラしないままカミソリとかメスで必要な部分を剥がす（核染は諦める） �A　QIAGENとかのFFPE用のRNAキットで抽出する（キシレンを使わない系） が方法としては現実的かなと思いました RNAが壊れていないかどうかはわかりませんが

(無題) 削除/引用 No.9738-8 - 2021/06/10 (木) 18:33:27 - ema ＞ヘマトキシリンでの染色、メチルグリーンの染色は、核酸のクオリティーには影響を与えない 何らかの作業はすべて影響を与えます。なるべく少ないステップで観察できる処理ができれば分解が少なくて済む、というだけです。 ＞xyleneでparaffinを除外 サンプルはパラフィン包埋切片なのでしょうか。凍結切片だと思って話をしていました。パラフィン除去をしてから、さらに染色工程が必要です。 パラフィンブロックを作る過程において既にRNAの品質が悪くなっており、FFPEでのRNA解析技術を教室で確立されていらっしゃらないならお進めしません。 RNA-seqを行う機器は何でしょうか。 RNA-seqという技術に対して疑問を投げているのではなく、 どんな実験デザインで何が見えればいいのか、次世代にかける前のサンプル取得、品質管理の段階で疑問を感じているのです。

(無題) 削除/引用 No.9738-7 - 2021/06/10 (木) 14:23:08 - けんけん みなさん、ありがとうございます。諸事情あって、再依頼が不可能な検体です。 ＞しかしそれでRNA-seqをして十分な品質のデータが取れるかはかなり不安です。 RNA-seq自体はやれば何かしらできてしまう実験ですが、RNAの品質が悪ければ全く無意味なデータが得られます。 マウス検体であるなら取り直されることを強くおすすめします ＞ただ、そのスライドの状態がどんなものかわからないのですが DNAならともかくRNAは厳しいんじゃないかなと思います みなさんが、RNA-seqを否定されるので、不安になってしまうのですが、slide自体は新しくcutされたものなので、laser captureであっても、掻き取りであってもRNAの質自体は同じですよね？ 基本的にヘマトキシリンでの染色、メチルグリーンの染色は、核酸のクオリティーには影響を与えないということでいいのでしょうか？また、実際の所染色は、どうやって行うのでしょうか？xyleneでparaffinを除外するようには思えませんが。

(無題) 削除/引用 No.9738-6 - 2021/06/10 (木) 10:21:05 - aaa うちはLMDの時はヘマトキシリンで核染してました 直にかき取る時はチップか注射針です ただ、そのスライドの状態がどんなものかわからないのですが DNAならともかくRNAは厳しいんじゃないかなと思います

(無題) 削除/引用 No.9738-5 - 2021/06/09 (水) 19:24:59 - AA フォイル付きスライドではないからLMDでは取れない、ということであれば そぎ取ってくるしかありませんね。 しかしそれでRNA-seqをして十分な品質のデータが取れるかはかなり不安です。 RNA-seq自体はやれば何かしらできてしまう実験ですが、RNAの品質が悪ければ全く無意味なデータが得られます。 マウス検体であるなら取り直されることを強くおすすめします

(無題) 削除/引用 No.9738-4 - 2021/06/09 (水) 18:01:11 - ema PALM（Zeiss）のLMDは無理やりはがすメソッドがあります。ロスは大きいです。 コントラストがつく照明なので無染色でも形態がしっかり分かれていれば囲ってとれます。 貴施設のどこかにあれば借りる、当研究室は外部からの利用を受け付けています。

(無題) 削除/引用 No.9738-3 - 2021/06/08 (火) 22:24:58 - hjkl LMDの時の染色はメチルグリーンよく使う。主に核が薄く染まる。RNase free売ってるかどうかわからないけど探してみてください。

(無題) 削除/引用 No.9738-2 - 2021/06/08 (火) 22:16:24 - hjkl たぶんもう一度やり直すことになると思うので、時間とお金のことを考えたら、LMD用のスライドグラスを買って、先方に送ってそれで改めて準備してもらった方がいい。それでRNA仕様の準備の上でLMDやった方がいい。LMD機器なければ大学間共同研究施設を利用すれば他大学行って教えてもらって行うこともできる. こういうことは見切り発車すると大抵失敗するので、急がずに周到に準備して１回で決めるつもりでやった方がいい。最近ようやくわかった。

スライド標本の削り取り方 削除/引用 No.9738-1 - 2021/06/08 (火) 18:15:44 - けんけん マウスのスライド標本を共同研究先からいただきました。スライド上のある部位を削り取ってRNA-seq解析を行いたいのですが、LCM用のスライドではありませんのでLCMは行うことが不可能です。 金属の棒等を使っての削り取りを考えています。 今の段階では、標本は透明なので、標本を何かで染色して、検体を弱く染めて、見えるようにしてから削りたいのですが、そういったことは可能でしょうか？可能ならば、どういった手法がかんがえられますでしょうか。

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