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(無題) 削除/引用 No.9744-9 - 2021/06/15 (火) 17:41:17 - G25 ネガコンは必ずしも必要でない実験だし（というか、こういう実験でネガコンをとる人はあまりいないであろう）、 ネガコンで見極めたいのは、偽陽性、つまりインサートが入っているのと同じバンドが出ないかどうかであって、そうではなかったのだから、 出てきたバンドの正体がなんであれ、実験の本質とは関わりないです。 サンプルのなかに目的のインサートの存在を示すものがあったなら、それで良し。 目的のものが一個もとれなかった場合なら、ネガコンで起こった変なことはコロニーPCR実験系のなんらかの問題がおこっていることを反映しているのかもしれない、と検討する端緒程度にはなるかもしれない。 で、あとは、なぜそういうことが起こったかという好奇心だけの問題。 想定外の現象に好奇心をもつのは大いに結構。 ただし、それだけの情報では確定的な真相は永遠にわかりません。 大いに興味があるのなら、もうちょっと自分で調べて手がかりを提示しなくては（簡単で核心に迫れるのはシークエンスかけちゃうこと。あたりクローンのシークエンスのときに、サンプルの一つとして加えておくとか）。

(無題) 削除/引用 No.9744-8 - 2021/06/15 (火) 15:07:43 - G25 >しかし、全長が増幅される可能性自体はあると思いますので、結果としてバンドが出ているならそれが全長が増幅されたPCR産物でないとも言えないとは思います。 もろんその可能性は排除しません（かなり低いと思いますが）。 しかしむしろ「プラスミド全長のサイズに一致するバンドが出た。だからこれはプラスミド全長がPCRされた産物に違いない」と、深く考えもせず飛びついてしまうようなことは、サイエンティストとしては甚だ危険であり自戒しなければならないことだと思うのですよ。 そう思ったから、質問への回答から外れたコメントをあえてさしはさんだ。

(無題) 削除/引用 No.9744-6 - 2021/06/15 (火) 11:10:48 - AA >>競合PCRが起こる場合、長い方のPCRは競り負けて産物が見えることは稀 ご指摘ごもっともです。当然というのは言い過ぎでした。 しかし、全長が増幅される可能性自体はあると思いますので、結果としてバンドが出ているならそれが全長が増幅されたPCR産物でないとも言えないとは思います。 質問者さんへのアドバイスとしては、インサートの有無を調べるという確認実験で結果があやふやになっては元も子もないですから、普通はどんな結果が出うるか予めよく検討しておくかと思います。 PCRでやるなら、インサートのほうがプラスミドより短いなら伸長時間を縮める、インサートにしかアニールしないプライマーを使う、など、やり方次第で余計な情報が生じないようにする事ができます。 というかそもそもMCSに入っているなら制限酵素で切り出して確認すればよいのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9744-5 - 2021/06/14 (月) 19:46:04 - asan >使っているプライマーはマルチクローニングサイトの両端に結合するものを用い、DNAポリメラーゼにはPrime Star GXLを使用しました。 考えられることはありますか？ これだけでは情報が少なすぎて何がどうなってるのかわからんので、そもそも自分で考えて考察すべきだとおもんだけど、大腸菌で増やしたベクターの一部が知らない間に2量体化してたってことはある。完全にしたわけではないが、そうでなければ説明できないような制限酵素パターンになったから。 通常のMCSで切ってるだけだと同じサイズのものが2つになるからわからないんだけどね。

(無題) 削除/引用 No.9744-4 - 2021/06/14 (月) 18:51:00 - G25 >プラスミド全長に相当するバンドが確認されました。 長さがそれに相当するというだけで、プラスミド全長かどうかは未確認ということですよね（ちなみにcccの移動度と一致するという意味ではなく、linear DNAのサイズでってことですよね）。 「プラスミド全長」とは全く関係のないartifactの可能性も排除できません。 >ぐるっと一周分の産物が増幅されるのは当然ではないでしょうか。 当然と言いきれるほど易しいことではないぞ。 その場合、ぐるっと一周した産物の両端にあるであろうプライマーセットは、同じにその産物の両端に、合わせて二箇所、MCSを挟んだかたちでアニールできる。競合PCRが起こるわけだが、こういう場合、長い方のPCRは競り負けて産物が見えることは稀だとおもう。

(無題) 削除/引用 No.9744-3 - 2021/06/11 (金) 17:21:52 - AA プライマーの設計がMCSの両端なら空ベクターにもアニーリングするので、 めっちゃ短い産物または、ぐるっと一周分の産物が増幅されるのは当然ではないでしょうか。 inverse PCRでプラスミドを線状化するときの、端っこがややオーバーラップしているような状態、といえばわかるでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9744-2 - 2021/06/11 (金) 16:00:00 - おお >プラスミド全長に相当するバンドが確認されました。 ちょっと把握しきれてないかもしれないですが、使った量が多すぎて、テンプレートのバンドが見えたか、ノンスペか。

インサートチェックPCRによりプラスミド全域の増幅について 削除/引用 No.9744-1 - 2021/06/11 (金) 15:43:48 - 初心者 クローニング後のプラスミドについてインサートチェックPCRを行いインサートチェックを行うのですがネガコンとしてプラスミドのみを入れたものをPCRにかけたところ、プラスミド全長に相当するバンドが確認されました。 使っているプライマーはマルチクローニングサイトの両端に結合するものを用い、DNAポリメラーゼにはPrime Star GXLを使用しました。 考えられることはありますか？

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