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(無題) 削除/引用 No.9767-7 - 2021/06/25 (金) 20:38:49 - あの PCR装置同じメーカーの純正品でない、マイクロプレートを 使ったときに、そういう状況に遭遇したことがあります。 対応機器のリストに入っていたし、増幅もしたけど、 バラついてた。

(無題) 削除/引用 No.9767-6 - 2021/06/25 (金) 16:22:41 - おお ＞例えば、tripicateをつくってそれぞれ半量ずつを別の機械にかけたら、同じパターンでばらつくでしょうか？ G25さんがおっしゃっているように、色々と検証したほうがいいでしょう。結構そういうのを無視して（検証などしないで）、公式のようにこれがおかしくなったら原因はこれだと信じ切ってしまい余計に収集がつかなくなるのを見たりしてきてます。 もしかしたら試薬のどれかが古くなっているとか、、、試薬も共通で使ってますか？

(無題) 削除/引用 No.9767-5 - 2021/06/25 (金) 14:36:40 - G25 >複数機器で同じ問題があることから、機器の問題でもないような気がしています。 それは決定的根拠にはならないでしょう。 決まったパターンでバラつくわけでもないんでしょう？ 共通点がばらつきが起こるってだけなら、機械がみんな狂っているってこともありえるのでは？ 例えば、tripicateをつくってそれぞれ半量ずつを別の機械にかけたら、同じパターンでばらつくでしょうか？　（どちらの機械でも高いものは高く、低いものは低くでるとか）。 多くのラボで、放ったらかしししているのを見ていますけど、 本来、リアルタイムPCR装置は特に調子が悪くなくても定期的にvalidationやcalibrationしないと動作保証されないものです。 キットなどを使って自前でやるか、サービスを呼ぶか、いずれにしろある程度費用をかけて手入れするのが良いと思います。 >頻繁にqPCRをやるラボではないので、 だからかえって、メンテが行き届いていない疑いがあります。

(無題) 削除/引用 No.9767-4 - 2021/06/25 (金) 13:43:39 - AA ピペットそのものの校正は大丈夫でしょうか。 トラブルが起きているときは何かしらがおかしいはずなので、 操作にしろ機械にしろ、要素を除外するのを早まらないほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9767-3 - 2021/06/25 (金) 12:42:26 - 例 SYBR Greenでターゲットの濃度が薄く、CT値が30超えてくるとばらつきますね。

(無題) 削除/引用 No.9767-2 - 2021/06/25 (金) 11:12:44 - seventh biologicalなduplicateではなくtechnicalなduplicateで差が出て、かつ機器のエラーでないなら、手技の差なのでは？ 例えばテンプレートを含むすべての成分を複数ウェル分プレミックスして分注した場合、ちゃんと混合・分注できていれば差は出ないはずです。 この場合大きな差が出るのは機器のwell間の誤差やテンプレート濃度やプライマー設計が悪い時などです。 テンプレートだけウェル毎に分注に切り替えて差が出てくるようだとここのピペット操作の影響です。 どんな条件か（テンプレートの濃度の高低、どの程度のCtの時か、すべてのプライマーペアで起こるのか特定のプライマーだけか、プライマー設計の妥当性は明らかになっているか）詳しく示しされてないとメーカー各社のトラブルシュートをまず確認しろとしか言えないです。 テンプレート分注などは重要な部分ですが目で見てわかるものでもないですし。 biologicalな場合はtotal cDNA量を揃えた場合でもサンプルや条件で結構ばらつきます。

qPCR duplicate間のばらつき 削除/引用 No.9767-1 - 2021/06/25 (金) 10:33:18 - 灰 タイトルの通り、qPCRがうまくいきません。 同一サンプルduplicate間でのばらつきが異常に高いです。CT値が1〜2くらい違うこともよくあります。 検量線もまともにひけていません。 見た目ではwell間でvolumeに差がなく、CT値の差が大きすぎることからも、ピぺッティングエラーなど手技的な原因ではないように思います。 Melt curveを見ましたが、非特異的な反応がおこってるわけでもなさそうです。 とりあえず試薬を新しくしたり（メーカーも変えました）、プライマーを新しくしたりなどの対策はしましたが、やはりうまくいきませんでした。 研究室のほかの人も同じようにうまくいってません。複数機器で同じ問題があることから、機器の問題でもないような気がしています。 何年かqPCRはやっていますが、こんな現象に遭遇したことがなかったです。 頻繁にqPCRをやるラボではないので、周囲に詳しい人もいなくて困惑しています。 ほかに確認すべきことや、アドバイスなどいただけるとうれしいです。

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