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(無題) 削除/引用 No.9773-10 - 2021/07/03 (土) 17:49:47 - ゆうや ありがとうございます。 伸長時間短い場合と長い場合とで検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9773-9 - 2021/07/02 (金) 10:21:50 - おお >[Re:7] ゆうやさんは書きました : > 条件決まる前にまず非標識のプライマーで検討して問題なく増幅が確認されたら、標識プライマーでしようかと考えていますが、標識の有無はPCRに何かしら影響をもたらしたりはしないのでしょうか？ > （まず非標識で条件検討しようかと考えている理由は研究費の関係です） アニーリングする塩基はいっしょで５末端になにかついてもアニーリングが阻害されるとは考えられないですし、そういうラベルで条件を見失ったという話は今の所聞いたことはないです。 > > 伸長時間が1min/kbであれば、100bpであれば10秒程度で良いのでしょうか？調べますと最低1minという記載もありました。 1min/kbは目安です。１００bpなら１０sでも大丈夫だと思いますが、途中でElongationのスピードが落ちたりとか塩基配列によってはあるかもしれないので２０sぐらいにしておくといいかもしれません。昔のプロトコールはそれぐらいの長さでも１分というものが多いとは思いますが、なるべく３’末端までちゃんとポリメラーゼがほぼすべての分子で到達しているための保険であったりもします。最近改良された酵素はかなり確実に反応するようにはなってきてますので、１０sでもしっかりと増えるとは思います。 また、ポリメラーゼ反応を完結させるために長めに反応時間を取るのは一つのやり方ですが、そのために二次的に３’末端が変なところにアニーリングしたりしてターゲットの配列より長いノンスペがでるなど副反応が見られる系では、わざと1min/kbに忠実に時間を設定することもあります。

(無題) 削除/引用 No.9773-8 - 2021/07/02 (金) 09:13:03 - a > 条件決まる前にまず非標識のプライマーで検討して問題なく増幅が確認されたら、標識プライマーでしようかと考えていますが、標識の有無はPCRに何かしら影響をもたらしたりはしないのでしょうか？ > （まず非標識で条件検討しようかと考えている理由は研究費の関係です） そのままサイバーは？

(無題) 削除/引用 No.9773-7 - 2021/07/01 (木) 19:47:50 - ゆうや ありがとうございます。 色々と勘違いしていた気がします。 プローブとプライマーでまず違いますね、、。 条件決まる前にまず非標識のプライマーで検討して問題なく増幅が確認されたら、標識プライマーでしようかと考えていますが、標識の有無はPCRに何かしら影響をもたらしたりはしないのでしょうか？ （まず非標識で条件検討しようかと考えている理由は研究費の関係です） 伸長時間が1min/kbであれば、100bpであれば10秒程度で良いのでしょうか？調べますと最低1minという記載もありました。

(無題) 削除/引用 No.9773-6 - 2021/07/01 (木) 09:34:48 - おお >[Re:4] ゆうやさんは書きました : > ご回答ありがとうございます。 > プライマーの５’末端に蛍光色素などを標識して、100〜200bp程度を作成予定です。 > またプライマーに標識つけて短い合成鎖を作製となると、リアルタイムPCRに近いと考えますが、どちらかといえばリアルタイムPCRよりのプロトコールで試してみればよいでしょうか？ > > https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/quantitative-pcr-and-digital-pcr-detection-methods どれにどのように似ているのですか？蛍光だけで似ていると想像を膨らましているように聞こえて仕方がない。 qPCRといってもまあサイクルの設定なんか原理的に何ら変わらんからそこは普通のPCRと一緒。最後にメルティングポイントとかみつ必要ないからそういうのは違うと思うけど。

(無題) 削除/引用 No.9773-5 - 2021/06/30 (水) 22:23:49 - G25 >プラスミドの場合、まず制限酵素で切断しなければいけないとかもないのでしょうか だからないって言ってるんでしょう。 > どちらかといえばリアルタイムPCRよりのプロトコールで試してみればよいでしょうか？ その、どちらかといえばリアルタイムPCRよりのプロトコールって、どういうプロトコール？ 一般的にはアンプリコンの長さに応じて伸長ステップの時間を変えるだけですが。 一般的な目安で言われているのが、1 min/kb

(無題) 削除/引用 No.9773-4 - 2021/06/30 (水) 20:20:01 - ゆうや ご回答ありがとうございます。 プライマーの５’末端に蛍光色素などを標識して、100〜200bp程度を作成予定です。 プラスミドの場合、まず制限酵素で切断しなければいけないとかもないのでしょうか？ またプライマーに標識つけて短い合成鎖を作製となると、リアルタイムPCRに近いと考えますが、どちらかといえばリアルタイムPCRよりのプロトコールで試してみればよいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9773-3 - 2021/06/29 (火) 00:14:05 - おお Yes

(無題) 削除/引用 No.9773-2 - 2021/06/28 (月) 18:27:21 - 無名 何を普通とされているのかにもよりますが、特に問題ありませんが、逆に何を心配されているのですか？

PCRについて 削除/引用 No.9773-1 - 2021/06/28 (月) 17:06:47 - ゆうや いつも勉強させて頂いています。 プラスミドDNAの特定の配列100bp程度のDNA断片を増幅したいと考えています。 通常のPCRで可能でしょうか？

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