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(無題) 削除/引用 No.9777-11 - 2021/07/01 (木) 20:22:20 - ゆう G25さん 返信ありがとうございます。 ＞最後に溶かすTEにRNaseを入れて対処するのがクラシックな方法 この方法でやっております。 ＞核酸の吸光はヌクレオチドとくに核酸塩基に対するものだから、RNAが分解されたって吸光性は失われない。そういうプロトコールの精製では定量に吸光度を使うのは不適当。 よく理解できました。ありがとうございます。以後気を付けます。 AAさん 返信ありがとうございます。 ＞PCR後の泳動でははっきりとバンドが見えるのでしょうか？ PCR後の泳動はおこなっておりません…。今度からそこの確認も行ってみたいと思います。 ＞メンブレンカラムなどを使わずに、フェノクロを通してアルコール沈殿しているのであれば大腸菌のRNAがかなり取れるのでそれを見ているのだと思います。 フェノクロを通してアルコール沈殿というまさにこの方法で行っているため、大腸菌のRNAの吸光を見てるということで解決しました。 みなさんありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9777-10 - 2021/07/01 (木) 17:36:24 - AA >>PCRで増幅したものをミニプレップしています。 おそらくオーバーラップPCRでプラスミドから増幅した直鎖状DNA断片を、そのまま大腸菌へ形質転換し、コロニー形成、ミニカルチャー、をしているということかと思いますが、PCR後の泳動でははっきりとバンドが見えるのでしょうか？ タカラバイオのサイトに技術情報がありますが、うまく行っていれば割と生えてくるので、たぶんうまくいっていなくて、今回拾ったコロニーはすべて空だと思います。 プレップをどうやっているかにもよりますが、メンブレンカラムなどを使わずに、フェノクロを通してアルコール沈殿しているのであれば大腸菌のRNAがかなり取れるのでそれを見ているのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.9777-9 - 2021/07/01 (木) 16:54:24 - G25 RNase処理無しでAlkali/SDS法でプラスミドを精製して泳動したことがあるだろうか？　プラスミドよりはるかに強く検出されるものだよ（ネットのどこかに画像が転がっているかもしれない）。 最後に溶かすTEにRNaseを入れて対処するのがクラシックな方法だが（最近ではsoln Iなんかに濃い目にRNaseを入れておいて、Alkali/SDS下の過酷な条件で処理してしまうというのがトレンドだが）、リン酸ジエステル結合を加水文化しひて、RNAを断片化、モノマー化するだけで、ヌクレオチドは残っている。核酸の吸光はヌクレオチドとくに核酸塩基に対するものだから、RNAが分解されたって吸光性は失われない。そういうプロトコールの精製では定量に吸光度を使うのは不適当。 RNaseがRNAを分解するというのを、塩基やリボースやらの骨格をもバラバラにするとは思っていないよね。

(無題) 削除/引用 No.9777-8 - 2021/07/01 (木) 12:41:41 - ゆう おおさん 返信ありがとうございます。 >RNAのEtBrによる検出感度はDNAより数十倍劣ります。 このことは存じ上げておりませんでした。 >精製後のプラスミドに加えただけなら、RNAは分解されど、短くなっただけでRNAは存在していますし。 RNaseを加えればRNA自体なくなるような認識でした…。 >いや、それよりインタクトのプラスミドなのか、LigationとかInsertを入れる操作をしたのかとか、コロニーの数とか増え具合とか、、、 1塩基置換のプラスミドを作製していまして、元々のプラスミドと1塩基のみ異なるような30bpほどのプライマーを設計し、PCRで増幅したものをミニプレップしています。コロニーの数は18hほどincubateして3個ほどしかありませんでしたが、プラスミドが入っているものと考えていたため、あまり気に留めていませんでした。 mpさん 返信ありがとうございます。 制限酵素処理はしていないのでuncutのものを電気泳動しています。 TDFさん 返信ありがとうございます。 ＞EtBr染色では見えないかもしれませんが、通常のRNaseA処理では短鎖のRNAがかなり残っているし、こいつはEtOH沈殿では除けません。 このことも存じ上げておりませんでした。ありがとうございます。 おそらく短鎖RNAが存在しているため、吸光度では測定できるけれど電気泳動でのバンドが確認できないという風に今のところ考えております。また何かご意見がありましたら伺いたいです。

(無題) 削除/引用 No.9777-7 - 2021/07/01 (木) 08:47:44 - TDF DNAのバンドが見えない理由はトピ主からの情報待ちとして、吸光度に関してはRNAの持ち込みです。おおさんがおっしゃっているように、EtBr染色では見えないかもしれませんが、通常のRNaseA処理では短鎖のRNAがかなり残っているし、こいつはEtOH沈殿では除けません。

(無題) 削除/引用 No.9777-6 - 2021/07/01 (木) 07:17:32 - mp 泳動したdnaは何らかの酵素で切ったものですか？それともuncutのものでしょうか？大腸菌によっては精製が甘いとendAが混入し、酵素反応中にプラスミドが消化されてしまいます。uncutだったら話は別です。

(無題) 削除/引用 No.9777-5 - 2021/07/01 (木) 06:16:49 - おお RNAのEtBrによる検出感度はDNAより数十倍劣ります。さらに大抵精製の過程で分解されたりしますので、均一なサイズにならないだろうし、短ければ短いほど検出感度は悪くなるでしょう（Double strandを形成しそこに入り込むことを考えれば）。 ＞ミニプレップで精製する最後のステップ 具体的にどのステップかわからないですが、、、精製後のプラスミドに加えただけなら、RNAは分解されど、短くなっただけでRNAは存在していますし。 ＞pcDNAだと思います いや、それよりインタクトのプラスミドなのか、LigationとかInsertを入れる操作をしたのかとか、コロニーの数とか増え具合とか、、、 だと思いますというのも微妙だけど、、、プレートが回ってきて任されたということ何でしょうか。まあいろいろな立場の人がいるでしょうからそういうこともあるでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.9777-4 - 2021/07/01 (木) 03:24:04 - ゆう qqさん　おおさん 返信ありがとうございます。 ミニプレップで精製する最後のステップでRNaseを入れてるんですが、それでもRNAが精製されてしまう可能性はあるのでしょうか…？ また、RNAだったとしても電気泳動の際にRNAのバンドがどこかに見えるはずですが、どこにも見えないということはありえるのでしょうか？ transformしたDNAはpcDNAだと思います。また何かご意見があれば伺いたいです…。

(無題) 削除/引用 No.9777-3 - 2021/07/01 (木) 00:34:21 - おお ミニプレップはどの方法か存じ上げませんけど、コンセプトはQuick and dirtyでDNAが確認できればいいというものだから、それなりにいろいろなものが落ちてくるものです。OD値から考えるとRNAの可能性が高いですね。 TransformationしたDNAはなんでしようか？それによってどこを見直すか違ってくるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9777-2 - 2021/06/30 (水) 21:39:26 - qq DNAじゃないんじゃない？　例えばRNAとか。

ミニプレップ後バンドが見えない 削除/引用 No.9777-1 - 2021/06/30 (水) 19:21:39 - ゆう トピックの通り、ミニプレップ後電気泳動でバンドを検出しようとしたところ、バンドが検出できませんでした。 不思議なことに、吸光度で濃度測定を行ったところ5000ng/µlほどの濃度が検出できました。（A260/A280は1.9くらい） ミニプレップの途中ではペレットなどは見えているのですが、電気泳動でバンドが検出できない理由が分からないです。何か原因が分かる方がいましたら、教えていただきたいです。。

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