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6ウェルで上手く行くトランスフェクションが24ウェルで失敗する トピック削除
No.9783-TOPIC - 2021/07/06 (火) 10:48:00 - 村
293細胞で一過性トランスフェクションを行っています。6ウェルプレートだと良好な発現が確認されるのですが、24ウェルプレートだとほぼ発現が見られず、場合によっては48~72時間くらいで細胞が丸くなって死んでいきます。
トランスフェクションはTransITシリーズとOptiMEM+4% FBSを用いメーカーの推奨プロトコルで実施しています（下記）

6ウェル：培地2.5mL、プラスミド量2.5µg
24ウェル：培地0.5mL、プラスミド量0.5µg

ぱっと見6ウェルと24ウェルで培地量、プラスミド量が正比例しているので24ウェルだけ上手くいかないという事は考えにくいのですが、現状そのようになっております。
こちら似たような経験をお持ちの方いらっしゃいましたらお知恵貸していただけますと幸いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.9783-3 - 2021/07/29 (木) 00:55:32 - おお
>4%FBS入りのOptiMEMはTransITの公式プロトコール通りでしょうか？

基本的なマニュアルに書かれているプロトコールは血清なしでDNA-TransITコンプレックスを作り、血清が含まれる培地で培養している細胞にかけるという事になっているようです。DNA-TransITコンプレックスは培養している培地の１０％のVolumeで作るように書かれてますね。

６Wellではうまく行っているようなのでスケール変更に伴って何かが変わったのかもしれないと思えます。たとえばDNA-TransITコンプレックスを作るときチューブに試薬が吸着しているため容量が大きいとチューブに接する面積は２乗で増えますので、容量が大きいときはTransITのロスが大きく毒性をある程度回避しているとか。そうだとすればTransITの量を下げるとかすればいいのかもしれません。DNAとの比に関してはTransITだけを減らしてももともとよく入る細胞なので大きく変わるとは思えませんが、どちらでもいいでしょう。

DNAに関してはきれいなほうがいいに越したことはありません。これも毒性のあるもののチューブへの吸着の量の違いが生じているかもしれません。一度DNAだけ加えて毒性があるのか確認してもいいのかもしれません。簡易的な精製は等量の飽和尿素を加えて、３００mM Na Acetateにしてエタノールかプロパノールで沈殿したあと７０％エタノールWashしTEか水で再溶解すると結構きれいになります。

https://www.mirusbio.com/assets/protocols/ml009_transit_293_transfection_reagent.pdf

(無題) 削除/引用
No.9783-2 - 2021/07/28 (水) 19:04:02 - Karas
既に時間が経っているので解決しているかもしれませんが、答えます。

一般論としてスケールアップもしくはスケールダウンして遺伝子導入効率が変化する際の原因は第一にヒトの手技の変化。第二にプラスミド調整時の変化です。一度、いつも通り6 wellスケールでPlasmid/OptiMEM/TransITを作製し、24 wellスケール分だけを24 wellに加えてみて下さい。

あとは質問者の方の各論になりますが、気になる点が2つありまして、1点目は「OptiMEM+4% FBS」の記述です。4%FBS入りのOptiMEMはTransITの公式プロトコール通りでしょうか？今一度確認をお願いします。

2点目ですが、「場合によっては48~72時間くらいで細胞が丸くなって死んでいきます」という点です。毒性の高いタンパク質を過剰発現させた場合には丸くなって死んでいきますが、遺伝子は導入されていないが丸くなって死ぬ、というのは導入の問題ではなく細胞培養の問題である可能性が高いです。微生物のコンタミや培地の色をチェックしてみて下さい。

293細胞は比較的遺伝子導入の易しい細胞です。なので、
1. 健康で80％前後confluentの細胞
2. 普通のminiprepキットで十分ですが、キレイなプラスミド
を準備して公式プロトコール通りに行ってみて下さい。

6ウェルで上手く行くトランスフェクションが24ウェルで失敗する 削除/引用
No.9783-1 - 2021/07/06 (火) 10:48:00 - 村
293細胞で一過性トランスフェクションを行っています。6ウェルプレートだと良好な発現が確認されるのですが、24ウェルプレートだとほぼ発現が見られず、場合によっては48~72時間くらいで細胞が丸くなって死んでいきます。
トランスフェクションはTransITシリーズとOptiMEM+4% FBSを用いメーカーの推奨プロトコルで実施しています（下記）

6ウェル：培地2.5mL、プラスミド量2.5µg
24ウェル：培地0.5mL、プラスミド量0.5µg

ぱっと見6ウェルと24ウェルで培地量、プラスミド量が正比例しているので24ウェルだけ上手くいかないという事は考えにくいのですが、現状そのようになっております。
こちら似たような経験をお持ちの方いらっしゃいましたらお知恵貸していただけますと幸いです。
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