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Westernblot法によるp38検出 トピック削除
No.9786-TOPIC - 2021/07/07 (水) 10:31:47 - あい
同じような実験をなさっている方、ご教授ください。
現在、ある薬剤による細胞内シグナル伝達経路を明らかにするためにWesternblot法でp38のリン酸化を確認しています。
リン酸化p38を検出後、p38を検出しようと試みています。

5%スキムミルクでブロッキング後、ウサギ由来の抗体でリン酸化p38を検出。
その後、2Mグリシンバッファー(pH2.8)を使用してストリッピングを行い、5%スキムミルクでブロッキング後、マウス由来の抗体でp38を検出しています。

転写後メンブレンで、それぞれの抗体を用い一回目に検出するとバンドは確認できるのですが、リン酸化p38→p38検出の場合ストリッピングを挟むとp38のバンドがほとんど確認できない状態です。
抗原の消失も考え、リン酸化p38検出後ストリッピングを行い再度リン酸化p38を検出したらほとんど変わらないバンドが確認できました。

なにがおかしいのかわからない状態です。
お時間ありましたらご教授のほど宜しくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.9786-11 - 2021/07/07 (水) 17:22:03 - あい
>みさん
>無名さん
>emaさん
>おおさん

貴重なご指摘有難うございます。
ストリッピングではなくHRPの失活で実験を再度行いたいと思います。
また進捗がありましたらご報告いたします。

(無題) 削除/引用
No.9786-10 - 2021/07/07 (水) 16:42:59 - おお
>[Re:9] 無名さんは書きました :

>
> 良く分かりませんが、HRPでの副産物が悪さをしているのだと考えています。

私もその経験があります。特に強いやつは。なのでそういう強いやつは反応を抑えるための工夫をしたりしてます。

(無題) 削除/引用
No.9786-9 - 2021/07/07 (水) 15:25:17 - 無名
少なくとも私の実験系では
同一メンブレンで同じタンパクのリプローブ検出はたいてい失敗します。

分子量が近い別タンパクもダメ。

HRP発色の時にメンブレンが茶変色していませんか？

良く分かりませんが、HRPでの副産物が悪さをしているのだと考えています。

(無題) 削除/引用
No.9786-8 - 2021/07/07 (水) 14:34:37 - ema
過去に自分もやっていました。同じような現象になりました。他の方も言ってらっしゃいますが
＞ストリップせずに0.5%くらいのアジ化ナトリウム入りTBSTまたはブロッキング液で１時間くらい洗浄するだけで１回目に検出したHRPは失活するだけで良い

で十分です。

(無題) 削除/引用
No.9786-7 - 2021/07/07 (水) 14:23:44 - おお
わたしもストリッピングせずにAzideで失活後リプローブでもいいと思います。気になるなら次につかう予定の二次抗体だけで反応させて、検出してみてバックグランドがないか確認すればいい。

あまりこれだけの実験で時間を使うよりは、サンプルを同量２つのゲルに流してそれぞれの抗体で検出したほうがいいです。先に進めることも大事ですから。

(無題) 削除/引用
No.9786-6 - 2021/07/07 (水) 13:53:45 - み
よく読んだらラビット抗体とマウス抗体で種が違うな。

それならストリップせずに0.5%くらいのアジ化ナトリウム入りTBSTまたはブロッキング液で１時間くらい洗浄するだけで１回目に検出したHRPは失活するだけで良いと思う。
Rabbit phospho-P38抗体とanti-Rabbit２次抗体HRPが結合した状態で、Mouse anti-P38抗体とanti-Mouse２次抗体HRPで検出できる。

ご教授いただき誠に有難うございます。 削除/引用
No.9786-5 - 2021/07/07 (水) 12:51:57 - あい
御忙しいところ御時間をいただき誠に有難うございます。
いただいた御意見を参考に早速チャレンジしたいと思います。

>ぬさん
> @ストリッピングによりp38抗体特異的な結合の阻害
> Aストリッピングによりリン酸化p38が取れていないことによるp38抗体結合の阻害
> ・実験
> @転写後ストリッピングしてp38抗体で検出
> (ストリッピング前にp38やリン酸化p38の抗体は反応させない)
> Aリン酸化p38抗体で検出し、ストリッピングを行なった後、
> 二次抗体だけ反応させて検出
Aのストリッピングの確認は行いバンドは検出されませんでした。
@をこれから試してみようと思います。結果出次第報告させていただきます。

>おおさん
> 順番を逆にしてやってみてください。
順番を逆にして行ってみました。p38がしっかり確認できましたが、一方でリン酸化p38は本来出る場所にはバンドが現れませんでした。また、非特異的的なバンドが多数出てしまいました。

>みさん
> ストリッピングの問題なのかp38抗体の質・反応性の問題なのか。
> p38抗体はworkする抗体ですかね？
p38抗体は転写後のメンブレンに対してしっかりとバンドの検出ができているので問題ないと考えております。ストリッピング溶液の組成等を検討しようと思います。

(無題) 削除/引用
No.9786-4 - 2021/07/07 (水) 11:59:05 - み
ストリッピングの問題なのかp38抗体の質・反応性の問題なのか。
p38抗体はworkする抗体ですかね？

(無題) 削除/引用
No.9786-3 - 2021/07/07 (水) 11:24:46 - おお
順番を逆にしてやってみてください。

(無題) 削除/引用
No.9786-2 - 2021/07/07 (水) 11:18:51 - ぬ
私の場合、まず以下の2つを疑います。

@ストリッピングによりp38抗体特異的な結合の阻害
Aストリッピングによりリン酸化p38が取れていないことによるp38抗体結合の阻害

・実験
@転写後ストリッピングしてp38抗体で検出
(ストリッピング前にp38やリン酸化p38の抗体は反応させない)

Aリン酸化p38抗体で検出し、ストリッピングを行なった後、
二次抗体だけ反応させて検出

Westernblot法によるp38検出 削除/引用
No.9786-1 - 2021/07/07 (水) 10:31:47 - あい
同じような実験をなさっている方、ご教授ください。
現在、ある薬剤による細胞内シグナル伝達経路を明らかにするためにWesternblot法でp38のリン酸化を確認しています。
リン酸化p38を検出後、p38を検出しようと試みています。

5%スキムミルクでブロッキング後、ウサギ由来の抗体でリン酸化p38を検出。
その後、2Mグリシンバッファー(pH2.8)を使用してストリッピングを行い、5%スキムミルクでブロッキング後、マウス由来の抗体でp38を検出しています。

転写後メンブレンで、それぞれの抗体を用い一回目に検出するとバンドは確認できるのですが、リン酸化p38→p38検出の場合ストリッピングを挟むとp38のバンドがほとんど確認できない状態です。
抗原の消失も考え、リン酸化p38検出後ストリッピングを行い再度リン酸化p38を検出したらほとんど変わらないバンドが確認できました。

なにがおかしいのかわからない状態です。
お時間ありましたらご教授のほど宜しくお願い致します。
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