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(無題) 削除/引用 No.9796-20 - 2021/07/15 (木) 06:53:23 - YY NEBioCalculatorとか使えば一発ですよ。 まあ、手計算で理解するのはいいことですが、答え合わせに使えば勉強にもなります。

(無題) 削除/引用 No.9796-19 - 2021/07/13 (火) 23:29:42 - おお あ、計算値の検証をしてなかった、、、

(無題) 削除/引用 No.9796-18 - 2021/07/13 (火) 19:31:52 - G25 >[Re:1] ふぁーじさんは書きました : > 私の研究室ではモル比１：３、ベクターの量20ngにするよう言われました。 > > そこでインサートDNA(ng)=3×インサートDNA(bp)/ベクターDNA(bp)×ベクターDNA(ng)の式に従って計算すると、 > > 0.008ngと出てきました。 ってことは、ベクターのサイズ(bp)はわかっているんでしょ？ ズバリ、それを書いてくれれば説明しやすいんだけど。 ちなみに私の計算違いでなければ、20 bp インサート0.008 ng, ベクター20 ngとして逆算すると、ベクターサイズは150 kbになるのだけれど、 そんなはずないよねえ。せいぜい5、6 kbでないの？ だったら少なくとも0.008 ngよりも数十倍多くなるんじゃないか？

(無題) 削除/引用 No.9796-17 - 2021/07/13 (火) 12:12:08 - G25 > インサートDNAの分子量を調べてみると、Fw、Rvともに7500(μg/μmol)くらいでした。 > この場合だと、20bpで15000Da 1bpあたり750 Daという考え方になるのでしょうか？ いくらなんでも750 Da/bpというのはなにかの間違いでしょう。 どんなに重いヌクレオチドの組み合わせでも 750 Da/bpにはなりえません dNMPのMWが最小のdTMPで304、最大のdGMPで345ですから（重合するときに水分子 MW 18が一個取れるとか細かいことは置いといて）、1 ntでおおよそ330。 それを単純に二倍して1 bpのMW 660。実際はAT対、GC対以外の組み合わせはないので630-650くらいですね。そこから1 bp 660とか650という近似がきているんです。

(無題) 削除/引用 No.9796-16 - 2021/07/13 (火) 02:29:44 - おお >0.03ng使うとなると、計算上は(★)を0.04μlになりますが、量的に取れないので、0.4μlくらい使っても大丈夫、という感じでしょうか？ 量的に取れないからということではないですけど、、、、 必要があれば希釈してから必要量取ればいいだけです。１０倍希釈後だと容量が１０倍ですよね。 過剰量入れてもいいとは言いましたが、どなたかの指導のもとで実験を進めているようなので、基本的なやり方として指導の通りやってみてください。同時に過剰量加えたものも並行してやると言うならまあそれもありかもしれませんが。WEBで大丈夫だと言われましたとか言ってもあまり信憑性のない話かもしれないと思われても仕方ないでしょうし。またあなた自身もプロトコールを入手してうまく行かなかったときの代替え案を用意しておけばいいでしょう。

ライゲーションに関して　追加質問 削除/引用 No.9796-15 - 2021/07/13 (火) 00:23:14 - ふぁーじ おお様 ご指摘ありがとうございます・・・！ > インサートDNAの1 bpあたり750 Daとすると > > 750 x 100 umol/L= 75 mg/L= 75 ng/uL 750ではなく15000ですよね。 この指摘なのですが、FwとRvそれぞれの分子量を足して15000で、 これを濃度換算すると、150ng/uL これを更に200倍希釈して150/200=0.75ng/uL(★) 0.03ng使うとなると、計算上は(★)を0.04μlになりますが、量的に取れないので、0.4μlくらい使っても大丈夫、という感じでしょうか？ ＞これをいうと台無しかもしれませんが、オリゴをライゲーションするときは大過剰入っていてもほぼ間違えなくプラスミドが取れるので、かなり適当にやっても大丈夫ではある（すでに指摘があるように）。 計算の仕方を教員に報告しないといけなくて、細かく聞いていました。お手数をおかけしてすみません。

(無題) 削除/引用 No.9796-14 - 2021/07/13 (火) 00:02:41 - おお >[Re:13] ふぁーじさんは書きました : > G25様、何度も申し訳ございません。 > > インサートDNAの分子量を調べてみると、Fw、Rvともに7500(μg/μmol)くらいでした。 > この場合だと、20bpで15000Da 1bpあたり750 Daという考え方になるのでしょうか？ そうですね。６６０とか６５０DaというのはGCTAの塩基の平均値で計算する場合で、ライゲーションなどでは誤差の範囲と考えても大丈夫ということです。 > > > インサートDNAの1 bpあたり750 Daとすると > > 750 x 100 umol/L= 75 mg/L= 75 ng/uL 750ではなく15000ですよね。 > これを200倍希釈しているので、75 ng/uL×1/200=0.33ng/μl・・・(★) > という考え方で合っているのでしょうか？ あと７５を２００で割ったら0.3７５だけど、、、もともとの数字間違えているから関係ないと言ったら関係ないけど。 これをいうと台無しかもしれませんが、オリゴをライゲーションするときは大過剰入っていてもほぼ間違えなくプラスミドが取れるので、かなり適当にやっても大丈夫ではある（すでに指摘があるように）。

ライゲーションに関して　追加質問 削除/引用 No.9796-13 - 2021/07/12 (月) 23:19:27 - ふぁーじ G25様、何度も申し訳ございません。 インサートDNAの分子量を調べてみると、Fw、Rvともに7500(μg/μmol)くらいでした。 この場合だと、20bpで15000Da 1bpあたり750 Daという考え方になるのでしょうか？ インサートDNAはFw 100μM　1μL、Rv 100μM　1μL、TE　8μLをアニールさせ、さらにddH2Oで200倍に希釈しています。 インサートDNAの1 bpあたり750 Daとすると 750 x 100 umol/L= 75 mg/L= 75 ng/uL これを200倍希釈しているので、75 ng/uL×1/200=0.33ng/μl・・・(★) という考え方で合っているのでしょうか？ 計算上の必要濃度(インサート：ベクター＝1:1だとする)0.03ng(以前0.008ngと書いていたのですが、計算間違いでした)を含むには、(★)から0.1μL使えばよい、という計算でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9796-9 - 2021/07/12 (月) 18:39:11 - G25 ベクターのサイズ（bp)が情報が必要です。 DNAの分子量換算は1 bpあたり平均660 (出典によって多少前後あり）とします。一本鎖なら1 ntあたり330。

ライゲーションに関して　追加質問 削除/引用 No.9796-8 - 2021/07/12 (月) 17:47:24 - ふぁーじ G25様 恥ずかしながらベクターのモル濃度なのですが、 どうやったら求められるのでしょうか？ モル濃度ではなく8.24ng/μLという濃度なら求めたのですが・・・。

ライゲーションに関して　追加質問 削除/引用 No.9796-7 - 2021/07/12 (月) 17:41:14 - ふぁーじ おお様、G25様、ご説明ありがとうございます。 分子量を調べてみると、Fw、Rvともに7500くらいでした。 この場合だと、20bpで15000Da 1bpあたり750Daという計算になるのでしょうか？ また、 ＞100μMということは100 umol/L 1 bpあたり660 Daとすると 660 x 100 umol/L= 66 mg/L= 66 ng/uL の意味で質問です。 私はインサートのFw100μM　1 μL、Rv100μM　1 μLと、TE8μLをアニールさせています。 66 ng/uLというのは、FwとRvそれぞれの濃度を示していて、計算上の必要濃度0.008ngを含むには、0.008/66μLが必要となる、という計算になるのでしょうか？こんな少ない量がとれるのでしょうか・・・。 私の理解が追い付かず、申し訳ございません。

(無題) 削除/引用 No.9796-6 - 2021/07/12 (月) 17:32:59 - G25 だったら、やっぱり素人じみた垢抜けない計算するよか、ベクターの濃度の方をモル濃度に変換するのが早道じゃないかなあ。 >計算上必要なインサートＤＮＡが0.008ngとして、インサート：ベクターのモル比1:1として計算したいのですが、 モル比　ベクター：インサート＝1:3として計算したのが0.008ngじゃなかったっけ？ だったらそれを1/3倍すれば1:1になるが？

(無題) 削除/引用 No.9796-4 - 2021/07/12 (月) 17:14:52 - G25 100μMということは100 umol/L 1 bpあたり660 Daとすると 660 x 100 umol/L= 66 mg/L= 66 ng/uL というか、ベクターの方を重量/体積濃度からmol濃度に換算して、mol濃度ベースで考えたほうがスマートでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9796-3 - 2021/07/12 (月) 17:08:27 - G25 計算上はそうなるかもしれないが、固執することではないです。 むしろ、半端な知識に溺れて馬鹿をやる「賢こバカ」になりかねない。 ・アニールして作った二重鎖オリゴDNAは、投入したオリゴの100%がそうなるわけではないので、二重鎖だけ精製するステップを入れていないかぎり（そして、それは本目的のような場合は不必要である）、そもそも濃度のestimateがいい加減です。そんなのに依存して導いた計算にそれほどの価値はない。すくなくとも、投入したオリゴの量よりできた二重鎖オリゴの量はぐっと少ないと想定してやっていい。 ・ベクターとインサートの比率（モル比）が重要というのは、うまいことベクターにインサートが組込まれた産物ができる効率を高めるためです。比率がベストでなかろうと、効率が下がるだけで目的のものが全くできなくなるわけじゃない。そして、やろうとしているのは目的のものが一個でも取れれば良い実験だ。 デザインによっては極端な比率だとダブルインサートとかベクターのセルフライゲーションとか二量体とかの副産物ができてバックグラウンドを上げてしまって、作業効率が下がるかもしれないので、比率にはちょっと気を使ったほうが良いかもしれない。しかし、この実験のデザインではそうではないと思うんです。 おそらくベクターの方はリン酸化末端でかるセルフライゲーションしないような設計でしょう。例えば流行りのデザインで言うとBbsIで二箇所切断するというような。 一方、オリゴの方は対応する付着末端をもち、末端脱リン酸化状態だと思います。 もしそうなら、ベクターが過剰になってもセルフライゲーションや二量体なんかができる心配はないし、インサートが過剰でもインサート同士はライゲーションしないのだから、ダブルインサートとかインサートの重合とかを生じない。 ベクターもインサートも十分たっぷりと入れてライゲーションすればいいと思います。目安として重量比で1:1くらいで良いと思う。

(無題) 削除/引用 No.9796-2 - 2021/07/12 (月) 16:41:21 - おお >（ちなみになのですが、インサートDNA(bp)というのは、20bpくらいなのが通常なのでしょうか？） 作りたい物によっては数十kbpになることもあるし、BACなどを使うならその十倍の長さを扱うこともある。 CRISPRに関してはそのデザインの仕方にもよるかもしれないけど、以下のデザインでは２０bpとなっています。というかそれぐらい手元に資料があると思うのですが。 https://www.addgene.org/crispr/zhang/ もちろん特異性を考えてながければなど、いろいろな検討をしている論文もあると思いますが、調べたことはありません。興味があるなら調べたらいいと思います。 ＞次にアニールしたオリゴDNAなのですが、100μMに調製しています。そのあと、どう計算すればいいのかが分からなくなってしまいまして、 https://bitesizebio.com/20669/how-to-calculate-the-number-of-molecules-in-any-piece-of-dna/ １bpのMwを６５０で計算すれば近似的ではありますが計算できるでしょう。 いろいろなメーカーが換算表 WebベースのCalculatorをカタログやWebサイトに公表しています。調べてみたらどうでしょう。昔はプロメガやNEBのカタログなどをよく見てましたが、いまはどうなっているか詳しくはわかりません。

ライゲーションに関して　追加質問 削除/引用 No.9796-1 - 2021/07/12 (月) 15:51:15 - ふぁーじ 今CRISPRのライゲーションに使う、ベクターとインサートの濃度を調製しようとしているのですが、その計算方法が分からず困っています。 私の研究室ではモル比１：３、ベクターの量20ngにするよう言われました。 そこでインサートDNA(ng)=3×インサートDNA(bp)/ベクターDNA(bp)×ベクターDNA(ng)の式に従って計算すると、 0.008ngと出てきました。 （ちなみになのですが、インサートDNA(bp)というのは、20bpくらいなのが通常なのでしょうか？） 次にアニールしたオリゴDNAなのですが、100μMに調製しています。 そのあと、どう計算すればいいのかが分からなくなってしまいまして、どなたかわかる方がいれば、教えて頂きたいです。 よろしくお願い致します。

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