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(無題) 削除/引用 No.9811-16 - 2021/07/30 (金) 17:09:19 - AA 発現用のカセットを送達するための"運び屋"なので、 >遺伝子やcDNAを挿入するための空っぽのプラスミドが空ベクター、発現プラスミドベクターを発現ベクター というのが正確なのではという気がします。 とはいえこのあたりはかなり習慣的なものなのであまり目くじら立ててもしょうがないのかなと思います。 "vectorbuilder"なんて名前のサービスだって、IVT用のプラスミドのことをベクターとよんでたりするくらいなわけですから。

(無題) 削除/引用 No.9811-15 - 2021/07/30 (金) 16:46:52 - 三十路 > 遺伝子やcDNAを挿入するための空っぽのプラスミドがベクター これを空ベクター、発現プラスミドベクターを発現ベクター、で呼ぶことが多いです。

(無題) 削除/引用 No.9811-14 - 2021/07/30 (金) 14:58:32 - ベクター警察 線引きが難しい微妙なケースが多いのは承知していますが、自分の興味のある遺伝子やcDNAを挿入するための空っぽのプラスミドがベクターという語感です。

(無題) 削除/引用 No.9811-13 - 2021/07/30 (金) 14:41:35 - りる 自分自身プラスミドと言うこともあります。どちらでも違和感とかは全くないですね。少なくとも自分のまわりでは若い人でもプラスミドと言ってる人はいます。 たぶん、発現プラスミドベクターをベクターと略すかプラスミドと略すかの違いだけだと思います。

(無題) 削除/引用 No.9811-12 - 2021/07/30 (金) 14:22:44 - ベクター警察 解決して良かったですね。 構築してるのって（発現）プラスミドですよね。うちのラボの若い人もベクターって言いますけど。 ベクターにインサートを挿入して発現プラスミドを構築、っていうのはもはや年寄りの用語法なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9811-11 - 2021/07/30 (金) 12:48:57 - りる やはり問題は、PCR産物からPCRをかけるところにあるようでした。その過程をなくしたところうまく行きました。ありがとうございます。 目的のベクターはとれましたが、なぜ２ステップだとうまくいかないのかは不明のままです。

(無題) 削除/引用 No.9811-10 - 2021/07/21 (水) 10:22:08 - りる ＞nanashiさん ありがとうございます。おおさんのおっしゃられている通り、数百個生えてるのはうまくいってる時のコロニーの数です。コロニーPCRの結果からほとんど当たりだと考えています。1回目のPCR産物が取り込まれるような配列にはなっていません。 たしかに、PCR産物からPCRするところのステップが変な気はします。インサートの数を増やして、少し工夫すればワンステップでできそうなので、やってみます。 ＞おおさん おおさんが提案してくださったプランも検討はしましたが、制限酵素サイトの関係で難しかったです。 PlanBをいろいろと試してみようと思います。電気泳動をしてみるとなにかわかるかもしれないというのも勉強になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9811-9 - 2021/07/21 (水) 01:44:37 - おお >>コロニーは数百個くらいはできています >すいません、ギブソンは経験なく、in fusionの経験だけで書かせて頂きますが、こんなにギブソンってハズレコロニーが生えるものなのでしょうか。 これは多分私の「うまく行っているときはどれくらいコロニーが生えてますか？」に対する答えで、今回のデザインではコロニーが生えないと仰っていたと思います。 数百のコロニーがうまく行っているときに生えると言うならそこそこ実験系としてはワークしていると思います。 そうするとやはりプラスミドやPCRの過程でなにか起きていると思われます。 ２回のPCRが必ず悪いわけではないでしょうけど、色々な副産物が毎回出てくるという意味では増やせばいいと考えるより気を使ったほうがいいと思います。 経験的に違う観点からアドバイスするとするならば、こういうConstructionって同時にやってもある配列だけ入りにくかったり、稀に全くだめだったりするものです。なのでいつもPlan Bを考えておいて、できれば並行してやるようにしておくように心がけています（いつもやっているわけではありませんが）。 たとえば 「遺伝子Aー２Aーほかの蛍光タンパク質C」がすでにあるわけですよね。遺伝子Aー２Aーのどこかから蛍光タンパク質Cを切り出して、それに合うプライマーを設計して挿入するとかできそうですがどうでしょうか？ Gibson Assemblyは使ったことがないですけど、反応後半分ほど電気泳動してみるとCircularになっているのでなにかわかることがあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9811-8 - 2021/07/20 (火) 17:35:40 - nanashi Flagmentの作成なのですが、PCRを2回かけているとのことだったと思います。 1回目のPCRで作ったFlagmentだけでも、ベクターに組み込み可能な相同領域を持っているのでしょうか。 言い換えると、1回目のPCRで使ったプライマーの5'側15塩基くらいと、2回目のPCRで使ったプライマーの5'側15塩基くらいは同じ配列ですか？ 2回目のPCRをかけるときの鋳型DNAの5'側15塩基くらいと、2回目のPCRをかけるときのプライマーの5'側15塩基くらいは同じ配列ですか？ もし、ハズレコロニーの多くが1回目のPCR産物が組み込まれたものだとしたら、2回目のPCRをかけたつもりが、ポリメラーゼの3'→5'エキソヌクレアーゼ活性で、15塩基相同領域以外を残して削られて、1回目と同じものを結果として増やしているのかも、と思いました。

(無題) 削除/引用 No.9811-7 - 2021/07/20 (火) 16:19:52 - nanashi 一応、確認なのですが、 制限酵素で作ったベクターに対して、1断片を組み込むということですよね。 >コロニーは数百個くらいはできています すいません、ギブソンは経験なく、in fusionの経験だけで書かせて頂きますが、こんなにギブソンってハズレコロニーが生えるものなのでしょうか。 ベクターを得る方法が失敗している、PCR産物をもう一回PCRするという工程が問題を起こしている　ような気がします。 後者の場合なのですが、最初から1回のPCRでFlagmentを作れないのでしょうか。今は60bpくらいなら普通にprimer　作れますし。

(無題) 削除/引用 No.9811-6 - 2021/07/19 (月) 18:27:01 - りる JM109ではないですが、他のコンピテントでも試してみましたが、だめでした。 配列をDirect sequenceで確認済みというのは、PCR産物のことであってますか？ Gibson Assemblyで反応させた後のベクターのシーケンスを読むのは難しいですよね。 コンピテントの問題か。それ以前の問題かを明確にしたいと思うのですが。

α 削除/引用 No.9811-5 - 2021/07/19 (月) 08:56:43 - ぽー 以前、同じようにPCRでは増幅できている（配列はDirect Sequenceで確認済み）のに、クローニングに失敗し続けた時に、コンピテントセルをDH5αからJM109に変えたらうまくいったことがあります。

(無題) 削除/引用 No.9811-4 - 2021/07/18 (日) 16:04:18 - りる もう少し詳しく書いた方がいいのかもしれないので追記しておくと、ある遺伝子AのあとにT２Aと蛍光タンパク質Bを発現させようと思っています。 同じプライマーで「遺伝子Aー２Aーほかの蛍光タンパク質C」という並びで成功している人がいます。

(無題) 削除/引用 No.9811-3 - 2021/07/18 (日) 16:00:15 - りる コロニーは数百個くらいはできています。たぶんコンピテントセルはワークしていると思います。 UVについてはあまり気にしていなかったので、これからは気を付けたいと思います。 見てもらったところ、PCRのバンドが少しうすいのではないかと指摘されたことはありました。 PCR条件を少し検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9811-2 - 2021/07/18 (日) 03:51:01 - おお うまく行っているときのTransformationでコロニーは何個できましたか？典型的な使用例で２５ngつかって数千のようです。もしコロニー数がそれほど多くないなら、コンピテントはちゃんと働いてますか？ ＞NanodropでちゃんとDNAが回収できていることも確認しています。 ゲルから切り出ししたということでしょうか？UVを検出のとき当てすぎるとTransformationの効率が極端に落ちます。レーンの殆どの部分を銀紙で覆い、端っこの方だけDNAを検出してバンドの位置を確認するとかいろいろ工夫の仕方をよく聞きます。 PCRの条件をなるべく厳しくして、検出できてないような副産物であってもなるべく減らすというのも場合によっては有効です。

ベクター構築がうまくいかない 削除/引用 No.9811-1 - 2021/07/17 (土) 17:21:42 - りる 蛍光タンパク質の配列をPCRで増やして、制限酵素処理したベクターにギブソンアセンブリーを使ってインサートしようとしています。 なぜか蛍光タンパク質に20bpのリンカーをPCRで追加した場合にうまくいきません。大腸菌が生えてこないです。 plasmidからPCR（Q5を使ってます）で目的の蛍光タンパク質の配列を増幅。ゲル抽出したPCR産物を使って、さらにPCRを行い、20bpほどのリンカーを追加。その後、ギブソンアセンブリーという流れです。 リンカーを追加しない場合だとうまく入ってくれます。違う種類の蛍光タンパク質で同じプライマーを使ってうまくいってる人がいるのですが（蛍光タンパク質のprimerの領域の配列は同じ）、自分がやるとうまくいきません。その人にも見てもらったのですが、とくに違いなどはなさそうとのことでした。 自分はまだこの実験を始めたばかりなのでわからないのですが、こういうことってあるんでしょうか。何が起こってるのかもよくわかっていないです。 解決策などありましたら、教えていただけると嬉しいです。 泳動で目的の位置にバンドがでていることは確認しています。増幅自体はかかっているのかな、と思います。 NanodropでちゃんとDNAが回収できていることも確認しています。

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