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表皮シートのRNA抽出での、RNA分解について トピック削除
No.9817-TOPIC - 2021/07/22 (木) 17:51:40 - なお
マウス耳介の表皮のRNA抽出を行なっています。表皮での遺伝子発現をみたいので、RNA抽出前に真皮と表皮を分ける必要があります。耳介を採取後、背側と腹側に2分割し、真皮側をチオシアン酸アンモニウム入りPBSに浸して37℃で30分インキュベートして表皮と真皮を分離していますが、この過程でRNAが分解してしまっているようです。RNA分解を防ぐアウリントリカルボン酸を加えても、表皮まで浸透していかないのか、RNA分解を防げませんでした。分解を防いで表皮のRNAを抽出する方法について、詳しい方いらっしゃいましたら、ご意見頂けると助かります！
　
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No.9817-7 - 2021/07/29 (木) 12:46:58 - なお
そうですね！
凍結融解させて一度やってみたいと思います！

ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.9817-6 - 2021/07/28 (水) 10:41:00 - G25
試薬の浸透が十分でない、あるいは遅いんじゃないでしょうか。

Freshなサンプルだと、組織が生きているとか、細胞外マトリックスがしっかりしているとかで、試薬が浸透しlysisするとかRNaseを阻害するまえに分解が進んでしまうのが原因のような気がします。
もし試していないのなら、一旦、液体窒素などで凍結して組織を「殺して」からやってみては。

RNA精製では、試料を液体窒素やディープフリーザーで凍らせた状態で試薬を入れ、融解させつつ試薬を効かせるということもよくやりますね。

(無題) 削除/引用
No.9817-5 - 2021/07/27 (火) 22:27:38 - なお
返信ありがとうございます。

RNAは電気泳動までして分解していることを確認しています。
28sと18sのバンドがまだ残っているものもあるのですが、28sと18sの比が1対3くらいになっていてスメア状のものも検出されていたり、完全にスメア状のものしか検出されなかったり、、、という状態なので、RNAの分解で間違いないと思います。

抽出は、ISOGENU内ですぐにホモジナイザー処理しており、抽出されにくいこともないと思います。以前腸管とかでも問題なく抽出できているので、、、

吸光度から、RNA量もそこそこありますし、純度も問題ないです。

ちなみに、RNA laterにつけるとゴム状になってしまって上手く表皮が剥がれないと論文に記載されているようなので、試していません。

(無題) 削除/引用
No.9817-3 - 2021/07/27 (火) 16:55:32 - G25
>この過程でRNAが分解してしまっているようです

なにを見て分解していると判断したのでしょう。
泳動像がスメアしているとかRNA integrity numberが低いとか、定性的な根拠に基づくものでしょうか。
単に、吸光度などでみた収量が低いというだけなら分解とは限りませんね。

RNAの抽出方法にもよりますけど、Trizolのように別途DNAも回収できるような方法であれば、DNAの収量を内部標準に使うことができます。
DNAは想定通りの収量なのにRNAが取れていない→RNAの分解を含め、RNAの抽出に問題あり。

DNAの収量が低い上にRNAが取れていない→そもそも有効な細胞数が少ない、あるいはlysisが不十分。

(無題) 削除/引用
No.9817-2 - 2021/07/26 (月) 22:10:25 - ema
分解していると判断のは分解したRNAはそれなりの量検出できているのですね。何も検出できないのなら取れていない可能性もあります。
そのままの抽出でコラーゲンなどで回収しにくいというのはありました。真皮と表皮を分離したことはないですが、RNAlater,NucleoProtect RNAなどの
安定化剤処理をしてはうまく剥がれないのでしょうか。
https://www.promega.co.jp/litDB/pn000105.pdf

後大変かもしれませんが、すぐに凍結して、薄切しエタノール固定などで乾燥させ酵素を止め、レーザーマイクロダイセクションで真皮と表皮を分けるというのは。

表皮シートのRNA抽出での、RNA分解について 削除/引用
No.9817-1 - 2021/07/22 (木) 17:51:40 - なお
マウス耳介の表皮のRNA抽出を行なっています。表皮での遺伝子発現をみたいので、RNA抽出前に真皮と表皮を分ける必要があります。耳介を採取後、背側と腹側に2分割し、真皮側をチオシアン酸アンモニウム入りPBSに浸して37℃で30分インキュベートして表皮と真皮を分離していますが、この過程でRNAが分解してしまっているようです。RNA分解を防ぐアウリントリカルボン酸を加えても、表皮まで浸透していかないのか、RNA分解を防げませんでした。分解を防いで表皮のRNAを抽出する方法について、詳しい方いらっしゃいましたら、ご意見頂けると助かります！
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