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(無題) 削除/引用 No.9852-15 - 2021/08/19 (木) 15:06:18 - oyaji その後、”やれば入る状態”になりました。（油断は禁物） 昨日は、大腸菌があまり増えず、”ダメ元プレップ”。 「やってみるか」で、調べたところ、２個とも成功。 うまく行く時はこんなもの。量も必要量以上。 発現ベクターはできた様です。これからフラグメント入れて、検定です。 年寄りは”職人の技”で、行くですね。 今後、人工遺伝子は、取り入れていこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.9852-14 - 2021/08/16 (月) 11:49:49 - oyaji その人工遺伝子、以前より検討中です。 オリゴはその会社にお願いしています。やるとしたら、人工遺伝子＋PCR用オリゴ。 時間も取れないし、失敗して１ヶ月失っており、真剣に検討中。 一回目はサンプル（タダ）というサービスもある。 ・・・と言いつつ、今日は入ったようです。 午後、ミニプレップ。上手くいくと、次回で発現ベクター完成。 今日も地方駅弁大学は”無人くん”です。 家に居場所がない私が、実験するだけ。 カケンヒも書きませんと、、、

(無題) 削除/引用 No.9852-13 - 2021/08/15 (日) 17:20:13 - あかね IDT gblock ~500 bp 11000ですよ。 https://sg.idtdna.com/jp/site/custom_gblocks.html

(無題) 削除/引用 No.9852-12 - 2021/08/15 (日) 05:23:44 - oyaji みなさま ご意見、誠にありがとうございます。 プラスミド構築に関し、”皆それぞれのスキーム”と言うのが、実感です。”職人の技”が集まった感。 in Fusion (gibson assemblyと実質同じかと)で一度うまくいかなかった経験（ショック大）もあり、基本、積み木方式が中心です. in Fusionの試薬はあるので、今後、やろうかと思います。オリゴの端に制限酵素サイトを入れるなど、「いざとなったら」積み木方式への変更が可能な安全運転で行こうかと思います。 ミニプレップ、やはり、成功率を高め（バックを下げ）、少なく拾う方式で行こうと思います。だいたい１コンストラクトあたり、２つでやってます。 現行の方式は、 制限酵素で方向性を付けてライゲーション、トランスフォーム。 翌朝、コロニーPCRで候補を２つに絞り、午後の遅めの時間にミニプレップ。続けて組み換え用に酵素処理。 ３日目、電気泳動、フラグメント抽出・回収、ライゲーション、、。 ・・・みたいな感じです。 基礎ベクター作成。その可否の検定（発現させる遺伝子を入れて、大腸菌、あるいは培養細胞で発現させて検定）。確認後、目的フラグメント（例えば長い遺伝子をドメインごとに細分化し、機能を検定）、、、と言う流れです。 エッペンドルフチューブでボイリングのミニプレップ・・・昔、よくやりました。TBという名前も懐かしい。知人に”６回回しの〇〇”という方もいました。（教室内の全遠心機を占有し、６回回す・・・100近い数のミニプレップ） コロニーから直接解析するクローニングチェッカーもいいと聞いています。（旧帝大のお金持ち） 60塩基のオリゴ（1200円）を複数作り、PCRで無理やりフラグメントを構築するのもやっています。PCR数回で200塩基程度の人口遺伝子を作成できます。 今日も、コロニー拾ってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.9852-11 - 2021/08/13 (金) 12:21:52 - G25 3 fragment ligationのことに言及されているので、当然、Ligation-independent cloning (LIC)はやっておられるのかと思いましたが、古典的な制限消化、ライゲーションでしたか。 確かに、一つのコンストラクトに中間段階を何段階も経て、その都度、おっしゃられているような苦労をするようなら、LICの導入が結局、時間的にもコスト的にも優れているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9852-10 - 2021/08/13 (金) 12:15:55 - G25 >次の遺伝子組み換えや発現実験があるので、4ugは欲しい。 培養時間を短縮して、それは高望みというもの。 あくまでもスクリーニングはスクリーニングと割り切って、その分、スループットを上げコストを低く抑えることを考えたほうがいいかも。 ダウンストリームに使用するプラスミドであれば、そんな泡食った精製はしたくないところ。

(無題) 削除/引用 No.9852-9 - 2021/08/13 (金) 11:56:36 - G25 XL. seriesの宿主菌は増殖速度や収量が低めだと思います。 JMシリーズのほうが速い。昔、同僚がJM83だったかを使っていて、なんでそんなマイナーな宿主使っているかと聞いたら、増殖が早く一日行程で培養からプラスミド精製まで行けるからとのことでした（当時、サンガー法で広範囲のゲノムを読むため、キロシークエンス用 deletion シリーズを量産していたと記憶する）。JM83みたいな珍しいやつや増殖の速さを売りにしている宿主菌製品じゃなくても、JM109とかDH5alphaみたいなありふれた宿主を使うだけでだいぶマシになると思います。 培養チューブじゃなくて、エッペンチューブに半分くらいの培地を入れてキャップをして培養。エアレーションが十分ではないかもしれないけど、プラスミドを制限酵素消化して泳動でチェックするくらいなら、それくらいでも行ける。 培地はLB、2xYTなんかでも行けないことないですが、TBを使ったりしていました。同じ条件で培養して菌体量はおそらく数倍に達します。 エッペンで培養した菌をそのまま遠心して集菌、プラスミド精製へ。 プラスミド精製はboiling methodが one tubeで済んでしまうし、所要時間が短くスループットも高い。プラスミド精製にかかる時間が短くて済むので、その分、培養時間を長く取ることも可能でしょう。 あるは、Alkali/SDS methodを塩析・アルコール沈殿（フェノール抽出省略）でやってもキットを使うよりスループットは高いと思います。 カラムを使うキットなんかは、コストがかかる上に、スクリーニングみたいな多検体処理をするには手間も時間もかかって煩わしい。

(無題) 削除/引用 No.9852-8 - 2021/08/13 (金) 11:33:11 - 独り言 クローニングの効率を上げたいのであれば、ligationはやめてgibson assemblyがお勧めです。 Gibsonの試薬自体は安くないですが、１反応2ul以下でも十分できるから費用もligationと比べて大してかからないし、一番の理由はかなり効率的にインサートが入ります。 私の場合では、コロニーピックは基本２コロニーしかピックしません。それでほとんどのプラスミド作製ができてます。３，４つのインサートを同時にいれることもだいたいうまくいきます。 そうすれば、ミニプレやアガロースゲル、インサート入っていないときのやり直しなど、手間、費用と時間の節約になります。

(無題) 削除/引用 No.9852-7 - 2021/08/13 (金) 11:12:53 - oyaji みなさま 貴重なご意見、感謝いたします。 急ぐ理由は、「時間がないから」です。 時間がない理由（身の上話になります。お許しください。） 所属は地方駅弁大学・国立。昭和生まれ。昔の同僚で実験しているのは自分だけ。 （実験ほとんどしない、論文読まない。もちろん書かない）大学院生様方がスタッフより偉い環境。今年の８月はカケンヒの申請書書き。９月になると、学生の試験、講義、、、。出張も多い。土日祝日・・・大分前からありません。 ・・・この状況で、実験しなくてはなりません（そもそも、これが無理筋かも）。 スピードを早める必要があります。 急ぐあまり、３フラグメントライゲーションや、ジャイアントプライマーをPCRで作り、、、などの変法でやることもありますが、経験的には、失敗する率が高い。 愚鈍なので、できるだけ、one-by-oneの積み木方式でやってます。 仕事は、新規発現プラスミドを作り、大腸菌や哺乳類細胞で発現。プロモーター解析など、、、 大腸菌はXL-10。プラスミドはPUC系。 ライゲーション、成功率は”それなり”と自負しています。インサート長の個人記録は１5 kb以上。 通常、ライゲーション後、コロニーを４〜８つほどPCRでスクリーニング。 当たってそうなものをミニプレップ。朝、コロニー拾ってから、電気泳動まで。18時には終わるようにしています。（以前は夜２３時などよくやりました。現在は、長くやると、翌日、体に響くオヤジ年齢body） 遺伝子組み換えに関しては、１日でやる時は、プレップを２〜４に限定しています。ミニプレップは100円程度のキット。キアゲンは200円（もする）。次の遺伝子組み換えや発現実験があるので、4ugは欲しい。 一つ外れるのも、”痛い”。PCRでスクリーニングできるだけでも、恵まれている環境です。 ＞＞＞＞ 「歩留まりを上げることが正攻法」 ・・・その通りです。できることはやっているつもりです。CIP、フラグメントの端を別々の制限酵素にする。 壁に当たった時は、以下の手法を用いています。 バックを下げるために一旦KM耐性のプラスミドに入れてから、PC耐性のプラスミドへ入れる、 ScaIでPC耐性遺伝子を切断、フラグメントを少量電気泳動して、回収率を検討、、大型の分厚い壁に当たった時は、カラのライゲーション（negative control）もやります。フラグメント自体のライゲーションは、バックグラウンドを見る上で、良い方法です。 どうしても・・・の時はフラグメント端の制限酵素をオリゴでPCRして強制変更。 Mach1・・・65300円。高価です。今回は見送らせていただきます。 NEBturbo・・・25000円から。買ってみます。 ＞＞＞ 地方大学の予算は年間１００程度。お国の研究費をいただけると、２００。 論文投稿費用が一つ２０万。年に２本以上論文を出すと、私費投稿の危険水域に入ります。 平均で、年間の論文数は３〜４。・・・実験に使える予算は年５０万円になります。 ありがたいのは、オリゴが安い。一塩基20円程度。オリゴなら、好きなだけ、発注できる。 遺伝子組み換えに関しては、 in fusion・・・もちろん無理筋。一回３千円＋高効率コンピタント（２千円）。 少量リガーゼで一回１００円、コンピタントは自作。 ・・・といったところです。ご意見を励みに、お盆シーズンも頑張る所存です。

(無題) 削除/引用 No.9852-6 - 2021/08/13 (金) 02:06:38 - おお >[Re:5] スノークさんは書きました : > 最後のパラグラフにお書きになっていることからすると、そうやって１日でコロニーから電気泳動まで行おうとしているのは、当たりクローンの歩留まりが良くないのをturnaround timeを短くすることで解決しようとしているということでしょうか。 > > だとしたら、歩留まりを上げることが正攻法だと思います。 >無理をせず、組み換え体を得る成功率を上げるという考え方もあると思いますが、、、。 >（PCRでスクリーニング、CIP, BAPでバックグラウンドコロニーの数を減らす、インサート入りのプラスミドのみコロニーを形成するように工夫、、、など） 　 わたしも、陽性コロニー率を上げることを最優先にします。ちゃんとやれば結構上がるもんですよ。１０個とったら９個ポジとか。なのでミニプレップは感触次第で６個ぐらいしか取らないとかいうこともよくありました。 １０kbsぐらいのインサートは難しいんだと言って、コロニーハイブリダイゼーションしてポジを２、３個見つけて調べると入っていたとか言う人がいましたが、同じインサートをにたプラスミドに入れたとき６０％の効率でポジを拾ったりしたこともありました。まあ効率なんてMCSのどこに入れるかとかでもまあまあ変動しそうなので、これだけをもって優劣をつけれないかもしれませんけど。 どのようにするかは個々人の研究スタイルかもしれませんから、間違っているとか言いませんけど意外と簡単に改善できる要素は複数転がっているだろうなと思います。 そうだなぁ。一つだけTipを書くと、Insert挿入用に用意したプラスミドのほうをそのままライゲーションしてコロニーの数をチェックしバックグランドの数を確認して、もし１０以上のコロニーができるならバックグランドが１０以下になるような量でLigationする。これで１００個ぐらいコロニーができればほとんどあたりです。６個ぐらい拾えば十分。たとえそれで１０個ぐらいでも案外うまく行っているし、１０個のミニプレップはさほど大変でもない。

(無題) 削除/引用 No.9852-5 - 2021/08/12 (木) 22:19:02 - スノーク 最後のパラグラフにお書きになっていることからすると、そうやって１日でコロニーから電気泳動まで行おうとしているのは、当たりクローンの歩留まりが良くないのをturnaround timeを短くすることで解決しようとしているということでしょうか。 だとしたら、歩留まりを上げることが正攻法だと思います。

(無題) 削除/引用 No.9852-4 - 2021/08/12 (木) 15:03:50 - おお 実はプレートのコロニーがある程度大きくなっていたらそれをなるべく取れるだけかき取ってミニプレップしても制限酵素などで確認できるくらいのプラスミドは取れます（pUCのOriなら確実）。 それでも不安ならそのコロニーの大腸菌を取れるだけかき取って、新しいプレートの３、４cm四方ぐらいのエリアに塗りたくれば、２、３時間もすればそのエリア一面に大腸菌が覆っているのが目に見えてくるのでそれを書き取ってミニプレップしてもいい。

(無題) 削除/引用 No.9852-3 - 2021/08/12 (木) 14:54:36 - あかね NEBturbo、増殖は早いです。

(無題) 削除/引用 No.9852-2 - 2021/08/12 (木) 14:17:07 - Egeria 私自身は使ったことがありませんが、増殖が速いとされるMach1という大腸菌がInvitrogenから販売されています。ずいぶん前ですが、このフォーラムにも使用している方の書き込みがありました。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=462 Mach1は一般的なK-12株ではない大腸菌株に由来しているそうで、これが増殖能の違いの原因のようです。

プラスミド 入り大腸菌。コロニーからミニプレップを１日で 削除/引用 No.9852-1 - 2021/08/12 (木) 13:39:38 - oyaji プラスミド 入り大腸菌コロニーのミニプレップ。 コロニーを拾い、インキュベーションし、ミニプレップを１日でやる努力をしています。 朝、コロニーを拾って、夕方にはミニプレップ、酵素処理、電気泳動までなんとかやってます。 問題点 コロニーを拾った後の、インキュベーションを短くする方法を探しています。 良い方法がありましたら、ご教示願います。 下記、方法を試していますが、結論は出ていません。 培地を変更する（LBから2xYTなど） 温度を変更する。（４０度くらいにすると、、、という話を聞いたことがあります。真偽不明） 無理をせず、組み換え体を得る成功率を上げるという考え方もあると思いますが、、、。 （PCRでスクリーニング、CIP, BAPでバックグラウンドコロニーの数を減らす、インサート入りのプラスミドのみコロニーを形成するように工夫、、、など）

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