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(無題) 削除/引用 No.9877-8 - 2021/08/26 (木) 19:56:46 - jumpin おお様 いつもありがとうございます。 抽出・精製時の分解や、夾雑物の影響も考えてましたが、具体的にあげることができず、苦戦していました。 内部標準のCtは想定内の値で問題ありません。 散々様 ありがとうございます。 濁り、ノンスペ、、と色々考えていました。 qq様 書き方が悪く、すみません。 CP法では見ていません。他人が解析したものを見るだけで、生データも見れない、他の解析もできない状況ですみませんが、あれこれ、原因を探っています。

(無題) 削除/引用 No.9877-7 - 2021/08/26 (木) 17:30:06 - qq ＞2nd Devivative Maximum法 は、Ctの閾値を求める方法ですよね。 Crossing-point法で調べるとS字状になるとかって言う話ではないよね？

(無題) 削除/引用 No.9877-6 - 2021/08/26 (木) 16:00:12 - 散々 増幅でなく、濁りを拾っているケース。

(無題) 削除/引用 No.9877-5 - 2021/08/26 (木) 02:28:45 - おお サンプルの調製は情報がなくわからないですが、RNAなら特に精製時の分解の可能性は考えてみてもいいかもしれません。もしそうでなければプライマーを変えるのが解決策になりえます。内部標準で増幅が見られるのだから、PCR試薬は一応ワークしていることになりますから。内部標準は期待したぐらいのCtになりますか（過去やその他の情報があるなら）。

(無題) 削除/引用 No.9877-4 - 2021/08/25 (水) 20:39:30 - jumpin おお様 ありがとうございます。 ノンスペも考えておりましたが、どこを改善するのがベストか決められずにおりました。 この検体に関しては、内部標準はS字カーブになりますが、某遺伝子はS字になりません。ただ、最終サイクルの蛍光強度はそれなりに高くなり、その値に問題はなく、PCR反応工程が一番気になっています。 電気泳動で確認できる環境にないため、今回はやっておりません。 機器に関しても、私自身はやっていませんが、誰がやっても曲線の形態は同じです。 公開できる情報も少なく、使える機器も限られている中の質問となり、すみません。 noname様 ありがとうございます。 教えて頂いたことをもう少し調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.9877-3 - 2021/08/25 (水) 16:42:35 - noname プローブを使っているのなら、何かしらの影響で 時間経過とともにプローブが分解されているのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9877-2 - 2021/08/25 (水) 16:03:43 - おお サイクルを回すたびに連鎖的にいろいろなノンスペが増えている可能性はないですか？ そもそも直線的に増えるとして、最後のサイクルではどれくらいの強さになっているのですか？正常にPCRがかかった場合よりかなり低いとかありませんか？ PCRのあとに増幅したものを電気泳動などで確認しましたか？ 機械に関してはあなたしか使ってないのですか？他の人が使っていたら、その時はちゃんと増幅が見られますか？他の人が使ってないなら、近所のラボでqPCRしているひとにその人がワークするPCR mixを作ってもらってかけてもらうとかもできますし。

real time PCRの増幅曲線 削除/引用 No.9877-1 - 2021/08/25 (水) 14:57:37 - jumpin 機器等詳細をお伝えできないこともありますが、アドバイスを頂けましたら、嬉しいです。 2nd Devivative Maximum法で導かれた増幅曲線が、S字にならず、プラトー相がありません。 Ct30前後のものも、立ちあがるというよりは、一次関数的(S字曲線の直線相の傾きより低い)に増えていくような感じです。 ウイルス測定のため、コピー数はそろっていないですが、検体だけでなく、ポジコンのような疑似検体でも増幅曲線の形は同じで、一次関数的でプラトー相がありません。 このようになる理由を考えています。 ベースラインの設定 抽出試薬やPCR試薬 機器や蛍光物質 複数考えられると思いますが、改善点も合わせて、一般的なレベルで教えて頂けたらと思います。開示されていない情報が多く、申し訳ありません。

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