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(無題) 削除/引用 No.9890-5 - 2021/09/09 (木) 05:47:19 - oyaji 変異の数が多いので、人工DNAを発注し、合成してもらう。 PCRで増幅し、制限酵素サイトを利用して、変異遺伝子を組み込む。 ・・・年寄りの方法ですが、比較的安全。 タカラのキット、点変異導入で、私は上手くいきましたが、コロニーの数がとても少ない。16も変異を入れるには、別の方法を予備に考えておくべきでは？

(無題) 削除/引用 No.9890-4 - 2021/09/03 (金) 08:56:23 - yyy ベクターに変異が入っているかもしれないことが気持ち悪いなら 変異を全部入れ終えた後にInsertを制限酵素で切り出して empty vectorに載せ替えたら良いだけです。

(無題) 削除/引用 No.9890-3 - 2021/09/02 (木) 11:20:25 - 分子生物学初学者です ＞AAさま ありがとうございます！ 確認泳動しか行っていなかったので、ゲル抽出を行ってやってみたいと思います。 目的遺伝子内のシーケンスは確認したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9890-2 - 2021/08/31 (火) 17:50:46 - AA Primestar MAXでと書いてるということはおそらくタカラの資料を読んで始めているのだと思います。 基本的には資料にあるとおりに実施すれば間違いはないですが、私の場合、PCR後のパターンがどうしてもきれいではないときはPCR産物を直接ではなく、一度ゲルから切り出しを行いメンブレンカラムで精製してから形質転換しています。 制限酵素処理については、PCRがうまく行っていれば鋳型のプラスミドとPCR産物の量比は圧倒的なので、PCR時点で鋳型量さえ多すぎなければあまり改善に寄与しないのではないかと思います。 PCRは高正確性酵素といえどもエラーは入りうるので、最終的に完成後はご自身の実験に関わる範囲についてはシークエンスしたほうが良いです。 どこまで必要かについてはご自身で判断してください。

takaraのPrime star MAXによる部位特異的変異プラスミドの作成 削除/引用 No.9890-1 - 2021/08/31 (火) 16:18:36 - 分子生物学初学者です いつも勉強させていただいています。 分子生物学実験を始めたばかりの学部生です。 Prime star MAXで既存の目的の遺伝子が導入されたプラスミドから１６箇所の変異を導入することになりました。 何回かに分けて導入を検討していますが、なかなか入りずらい箇所があり困っています。 このような場合は、DpnI処理をしてテンプレートの処理をした方が良いのでしょうか？（今はPCRかけたものをそのまま形質転換しています） また、Prime starMAXの特性として変異が入りにくいとのことですが、環状PCRなので、全ての変異を入れ終わった後に変異を入れた部位以外にもシークエンスをかけた方が良いのでしょうか？（今は変異部位のみ確認しています） 初学的な質問ですが、アドバイスいただけると嬉しいです。

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