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(無題) 削除/引用 No.9901-9 - 2021/09/11 (土) 04:27:42 - おお >一回目の検出が(原因はともかく)その強さに応じて二回目の検出に影響を与えているなら、 枯渇と書いていたので少し思い違いをしてたかもしれません。すいません。この件に感して、経験上中が抜けたような経験はありません。説明はできないんですけどね。 ＞現在検出はECL primeで行っており、露光時間は100秒 (飽和ピクセルが出現し始める時間)ぐらいです。 かなりシグナルを抑えている印象があります。ECL primeは使用経験がありませんのでさじ加減はわかりませんが、反応の副産物のせいでないとしたら、ストリッピングの条件が強すぎるため吸着した蛋白が抜けかけているとかそういうことなのかもしれません。 やはり２度目のプローブはマウスにするとか方法論を考えたほうがいいのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.9901-8 - 2021/09/10 (金) 09:44:26 - y コメントありがとうございます。 > そんなこと書きましたか？ 一回目の検出が(原因はともかく)その強さに応じて二回目の検出に影響を与えているなら、一つのバンドの中でもシグナルの強い中心部がより影響を受けるだろうという推論(したがって二回目はバンドの中心のシグナルが弱くなる)だったのですが、おかしいでしょうか。 現在検出はECL primeで行っており、露光時間は100秒 (飽和ピクセルが出現し始める時間)ぐらいです。チューブリンについても同じぐらいのシグナルの強さです。(チューブリンについてはもっと強烈にシグナルが出る抗体も所持していますが、multiplexのために弱めのシグナルになるように抗体、条件を選んでいます。)また、シグナルが極端に強いときに、メンブレン上に茶色いバンドが出現するのは他のWBでは何度も経験していますが、今回はそのようなことはありませんでした。 以上のことから、シグナルが強すぎるとは思っていなかったのですが、ご指摘をうけたので条件を更に検討してみようと思います。また蛍光WB用の二次抗体のサンプルがあるので、HRPによる影響かどうかはこれで切りわけられると考えています。残念ながら雑用がたてこんでおり、すぐに実験できないのですが何かわかったらご報告します。 ただ、二回目のWBの結果が正しいのかどうかが、感覚、あるいはduplicateのメンブレンによるWBの結果との比較でしかわからないとすると、hさんが最初におっしゃられたようにストリッピング後のWBの定量って全然意味がないのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9901-7 - 2021/09/10 (金) 07:25:13 - うりゃ 私も基質の酸化に一票

(無題) 削除/引用 No.9901-6 - 2021/09/10 (金) 01:23:00 - おお コンピューターの環境があまり良くなく読みづらかった部分がありましたので、把握できてなかったことをついかします。 ＞一回目のWBでは抗αチューブリン抗体(マウス)も共に加え、multiplexで行っています。一回目のWBでは抗αチューブリン抗体(マウス)も共に加え、multiplexで行っています。 チューブリンは通常（よほど工夫をしない限り）非常に強いシグナルがでます。それと同程度のシグナルがでるなら、やはりメンブレンかもしくはシグナルが出る部位の蛋白にダメージを与えていて、もしくは吸着した基質の副産物が吸着して、２回目以降のその部位のリプロービングを困難にしている可能性が高いです。 ＞もちろん、抗原、抗体依存だとは思いますが、ストリッピング操作で明らかに抗体を除けたという経験がおありの方は教えていただければ幸いです。 除けたり除けなかったりです。そのメンブレン一度マウスに対する２抗体だけでプローブしてみてください。多分バンドが検出されると思います。抗体のアフィニティー、ターゲットの蛋白に依存すると思いますので、リプローブする必要があるときは、なるべく弱いシグナルが出る方の抗体を先にして、シグナルも強くならないようにコントロールして、リプローブしてます。 立体障害と言いますが、ポリクロで染めてから、同一蛋白をモノクロで検出するとか必要なときにやったことがありますし（Erkではないですが）、お使いの抗体、 (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)とありこの蛋白はアミノ酸が３６０位あります。その上でp44/42 MAPK (Erk1/2) (137F5) Rabbit mAb #4695の方はエピトープがC末付近と書かれています。１００アミノ酸以上離れているのではないかと想像しますが。 推論はいいのですが、それに対して詰めれるところは詰めてください。

(無題) 削除/引用 No.9901-5 - 2021/09/10 (金) 00:15:42 - おお >基質が枯渇した時に抜けるような感じではなく、ただレーン毎の強弱が一回目と二回目で逆になっているという印象です。 そんなこと書きましたか？ １回目の反応がかなり強い場合その場所に影響を及ぼし、バンドがあった場所で２回目の検出がうまく行かないといっているのです。

(無題) 削除/引用 No.9901-4 - 2021/09/09 (木) 20:00:53 - y コメントありがとうございます。最初の投稿で改行がおかしな位置にはいり、見にくくてすみません。 >おおさん 基質が枯渇した時に抜けるような感じではなく、ただレーン毎の強弱が一回目と二回目で逆になっているという印象です。すでに一次抗体はかなり薄めです(5000~10000分の1ぐらい)が、もう少し条件を検討してみます。 また、S-S架橋を切っただけでは二次抗体に対する抗原性が失なわれることはないとのこと、了承しました。 > hさん リン酸化を見るのにはストリッピングしてやるのが普通みたいな雰囲気があるような気がしていたのですが、もし定量性がないということだと困りますね。 ストリッピングの後、二次抗体のみで反応させるのはやっています。ラビット、マウス両方の二次抗体を加えた場合、αチューブリン、リン酸化ERKいずれのシグナルも検出されませんでした。もっともこれだけでは、一次抗体が剥れているのか、二次抗体に認識されなくなっているだけなのかはわからない訳ですが。 抗体メーカーにも問い合わせてみます。引きつづき情報をお待ちします。

(無題) 削除/引用 No.9901-3 - 2021/09/09 (木) 15:38:13 - h そこまで詳しくはないですが、ストリッピング後のWBではタンパク量の差を見るのはやめた方が良いと言われたことがあります。ストリッピング操作によるタンパクへの障害がどの程度なのかわからないからです。ストリッピング後のブロッキング有無も人それぞれな気がします。 丁寧にやったとしてもinternal control以外に使うのはやめた方が良いというのが私見です。 また、一次抗体を問題と考えるならストリッピング→二次抗体→exposureで反応しないことを確認するべきではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9901-2 - 2021/09/09 (木) 15:17:06 - おお 特にECL PLUS以降のルミノールより強い基質を使ったとき、反応した基質が沈着したせいか、HRPとの反応でラジカルとか出て周りが参加されるせいかわからないですが、バンドが出た位置だけシグナルが出なかったり、極端に弱くなることがあります。期待するバンドが弱い抗体を先にプローブする、抗体濃度を下げる、基質の使い分けで強さをコントロールするなど工夫で改善するでしょう。 どんな2次抗体を使っているかわかりませんが。IPに使った抗体も普通種が同じなら、SDSPAGE（WB）で６０kDaと２５kDaに検出できる（邪魔なくらい）ので、S-S架橋を切ったので二次抗体に対する抗原性がなくなるということは考えにくいと思います（TrueBlotを使ってないなら）

ストリッピングについて 削除/引用 No.9901-1 - 2021/09/09 (木) 10:32:49 - y ウェスタンブロッティングにおける抗体のストリッピングについて皆さんの意見を伺いたいと思い、 書き込みます。普段ストリッピングはほとんどしないのであまり経験がないのですが、以下の手順で ストリッピング(とそれに続く二回目のWB)を行ったところ、おかしな結果を得ました。 1. 一回目のWB: 抗リン酸化ERK抗体(ウサギ、CST#4370)によって行い、検出。 2. 2％ SDS, 100 mM 2-mercaptoethanol, 62.5 mM Tris-HCl, pH6.7で50度30分処理により ストリッピング。(Cytivaのページにあったプロトコル) 3. 二回目のWB: 抗ERK抗体(ウサギ、CST#4695)によって行い、検出。 なお、一回目のWBでは抗αチューブリン抗体(マウス)も共に加え、multiplexで行っています。 結果: 一回目: αチューブリンのシグナルにはバラつきなし。ERKリン酸化レベルが高いことが予想される レーンはリン酸化ERKのシグナルが強く(3倍程度)、予想通り。 ストリッピング後の二回目: 一回目のリン酸化ERKシグナルが強いレーンでは全ERKのシグナルは弱く、 逆に弱いレーンでは強く検出された。 考察: 全ERK量がそれほど変動することはあまり考えにくい。実際、別のメンブレンで全ERKに対するWBを 先に行ったところ、そのような変動は観察できなかった。 実は一回目の抗体は剥れておらずERK上に残っており、二回目の抗ERK抗体との間で立体障害がある のではないか。ストリッピング操作は抗体を剥すというよりも、一次抗体分子のS-S架橋を切ったり することにより、二次抗体に対する抗原性を失なわせているだけなのではないか。 もちろん、抗原、抗体依存だとは思いますが、ストリッピング操作で明らかに抗体を除けたという 経験がおありの方は教えていただければ幸いです。 なお、一次抗体の動物種を変えてストリッピング操作をなくす(HRPを失活させるのみにする)、という のはすでに試しています。その場合も(文献で使われているような抗体のペアであっても)何となく立体 障害が疑われる傾向があったのでストリッピングを試している次第です。 duplicateの別メンブレンで十分という意見もあるでしょうし、自分もそう思ってきました。ただ、執拗 に同一メンブレンに拘るreviewerがいたりもするので、ストリッピングの妥当性を知りたいと思って います。

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