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(無題) 削除/引用 No.9919-9 - 2021/09/22 (水) 17:41:53 - ema 膜タンパクで非常に少ない発現の場合は抽出されているのに、見えないことがあります。私が過去に行ったのは少なかったのでディタージェントなどが入っていない可溶化タンパクバッファーでダウンスホモジナイズし、超遠心して膜タンパクを落として回収して、沈殿をSDS可溶化して検出したことがあります。

(無題) 削除/引用 No.9919-8 - 2021/09/22 (水) 01:37:03 - おお glycerolはBCAと反応します。許容濃度でもある程度発色します。

(無題) 削除/引用 No.9919-7 - 2021/09/21 (火) 21:43:25 - mir k様 ご指摘いただきありがとうございます。 グリセロールについては最初に入れると粘性があがってホモジナイズの効率が悪くなると思い、線維性の組織をよく扱うこともあり最後に入れようかと考えておりました。 10倍濃度のグリセロール＋BPBを作っておいて、最後に0.1容量入れようかと考えておりましたが（BPBがもしかしたら溶解しないかもしれませんが、、）、もしグリセロールを最初に入れる場合、最後に入れるBPBの溶媒は何が適当でしょうか。少量のメタノールなどがよいでしょうか。 ボイルの件、ありがとうございます。 そのように致します。

(無題) 削除/引用 No.9919-6 - 2021/09/21 (火) 15:55:39 - k 書かれている方法はImmunoblottingのための試料調製としてはごく標準的な方法ですのでimmunoblottingが目的ならば特に問題ありません。glycerolは、はじめのlysis bufferに含めていいです。可溶化効率の面から組織：溶液は1:10~1:20くらいが良いと思います。 膜タンパク質ということですので、中には加熱で凝集してしまうものもたまにあるので、はじめは加熱処理はありなし両方試した方が良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9919-5 - 2021/09/21 (火) 01:00:41 - mir おお様 ご指摘いただきありがとうございます。今回試したマイルドなバッファ−ですと収率が低いため、10w/v％で抽出して3mg/ml程度とちょうどよかったのですが、確かにSDSで可溶化を行うと収率が上がることが予想されるので、バッファー量は増やした方がよさそうですね。ありがとうございます。 RIPAも検討しましたが、ご記載の通りRIPAは非変性での可溶化が難しいとの情報がありましたので、SDSが0.1％と薄く収率が落ちてしまうのなら、SDSバッファーで十分に可溶化した方がよいのではと考えた次第です。 ただ、自分の分野の論文でRIPAは実際よく使われているため、トライしてみてもよいかとは考えております。

(無題) 削除/引用 No.9919-4 - 2021/09/21 (火) 00:39:32 - mir qq様 ご指摘いただきありがとうございます。以前サンプルバッファーでホモジナイズしたことがあり、その時は濃度測定を行いませんでしたが、WBでシングルバンドを検出できたので、やはりバッファー選択の問題なのかと思っております。 仰る通り、SDSを最初に使ってしまうと酵素活性の測定は難しいと考えております。サンプルが大量にあれば、酵素アッセイ用、IP用、WB用など、すべて抽出方法を変えて行うことができるのですが、サンプルが限られているため、複数の下流アプリケーションに対応できる最大公約数的な抽出方法がないかと考えたのがきっかけでした。

(無題) 削除/引用 No.9919-3 - 2021/09/20 (月) 05:19:46 - おお やり方としてはやってみてもいい方法論だと思います。 ＞10w/v％ 組織の重量のやく１０％が蛋白だと大体において思ってます（もちろん組織によって大きく違うでしょうけど）。その換算で行くと蛋白濃度は１０mg/ml。この濃度では本当にタンパク質が完全に抽出されているか不安です。ホントはその３倍量ぐらいのBufferで行きたいところです。あるいは抽出した不溶画分をもう一度同程度のBufferで抽出して最初の抽出液と混ぜるとか。もしかしたらほかのBufferもこれが原因でうまく抽出できてないのかもしれません。 状況によるでしょうけど、SDSは低温で沈殿しやすいです。ホモゲナイズ後ボイルして（１０mg/mlぐらいこ高濃度になるとこのボイルで変性蛋白が沈殿するので注意）なるべくプロテアーゼなど失活させて、その後の操作を室温でやると沈殿は避けられると思います。あるいはそのバッファーをしばらくOn Iceで静置して沈殿ができないようなら、低温で続けてもいいでしょう。ただどこかでボイルして置くほうが無難です。 それいがいのばっふぁーで抽出力がたかいものなら、 RIPA Bufferで一応非変性と言われていますが、物によってはInteractionがCoIPで見られないとか、活性が見られないという話はまあまああります。 生理的な塩濃度のバッファーに １％ Tx-100 0.1〜１％Deoxycholate 0.1％ SDS が入ってます。 場合によっては塩濃度を倍ぐらいに上げると効果が上がることもあります。

(無題) 削除/引用 No.9919-2 - 2021/09/19 (日) 19:07:15 - qq ＞で抽出しましたが、見たい膜蛋白がWBで確認できず、 というときは、抽出されていない残渣も適量のサンプルバッファーに溶解してWBしないと、WBで出なかったのが、抽出されなかったのか、それとも抗体で検出されていないのか判りませんから、ホモジネート、抽出液、残渣（を抽出バッファーで再懸濁したもの）をWBするのが良いです。 スクロース系の等張液でホモジナイズし細胞分画してみて可溶性画分と何種類かの膜画分のいずれにあるのかが判っていると、抽出条件で悩む必要も少なくなります。 うまく行くことが判っているのでなければ、市販キットの抽出液はおすすめできませんね。 酵素活性の測定もしたいとのことですが、SDSを最初に使ってしまうと、ちょっと難しいんじゃないかなと思います。

マウス組織からのタンパク抽出 削除/引用 No.9919-1 - 2021/09/19 (日) 01:56:26 - mir いつも拝見し勉強させていただいております。 マウス組織からのタンパク抽出についてですが、 保存しているサンプル量が少なく、WBだけでなく酵素アッセイなど様々な下流アッセイで使用できるよう非変性状態で可溶化したいと思い、Thermo Fisherから出ているT-PERや、ラボにあるTritonベースのバッファーで抽出しましたが、見たい膜蛋白がWBで確認できず、保存サンプルの一部をSDSバッファーで抽出しようと考えております。 時折論文で見られるようなSDS-PAGEサンプルバッファーで組織をホモジナイズしてタンパク質の可溶化を行うようなプロトコルですと、BPBや還元剤を含みBCA法での濃度測定で干渉するため、以下のプロトコルを考えて現在検討しております。一方で私が検索した範囲ではこのようなプロトコルは見当たらず、妥当なものかどうか、また改善点などお伺いできれば幸いです。 //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// 10w/v％程度でサンプルを1xSDS Buffer(Tris-HCl 62.5 mM, SDS3%程度, pH6.8)に入れ機械的ホモジナイズ（ビーズorポリトロン） ↓ ソニケーション ↓ 15000g, 15min ↓ 上清を回収。BCA法で濃度測定。 ↓ -80℃保存。 このうちWBで使用する分については、 上記1xSDS Buffer、DTT(終濃度: 100mM)、BPB(0.005％)、Glycerol(10%)を加え、それぞれの終濃度となるよう調整し、95℃で5分ボイル。SDS-PAGEへ。

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