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(無題) 削除/引用 No.9937-7 - 2021/09/30 (木) 07:11:19 - 硫安 >k様 ExpiCHO-S細胞に発現・細胞外に分泌させて、培養後は遠心した上清をフィルターろ過してから硫安沈殿に供していますので、細胞などの夾雑物ではないと思っています。 おっしゃる通りで硫安沈殿して10,000×g 30min遠心後は、最上層にずっと浮いているもの、溶液中を漂っているもの、ペレットになっているものの3種類があります。 確かに、それぞれを溶解させて目的蛋白質がどこに含まれているかチェックすることが先決ですね。やってみます。 参考になりました。ありがとうございます。 >おお様 貴重なご意見、ありがとうございます。 なるほど。やる価値はありますね。 共通機器に超遠心の機械もありますので、漂っているものを回収する必要が出てきたらトライしてみます。

(無題) 削除/引用 No.9937-6 - 2021/09/29 (水) 22:51:31 - k 私の経験の範囲では硫安沈殿は（それが確かにタンパク質ならば）普通にしっかりしたペレットになります。なので浮いてるのはタンパク質でない何かのように思います。ちゃんと沈殿しているものは全然ありませんか？沈殿してるのがあるらば、上清は浮いてる変なのも含めて捨てて、沈殿したものについてWestern blotting でものがあるかどうか、濃縮されてるかどうかをチェックして、あれば、そのまま先に進めば良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.9937-5 - 2021/09/29 (水) 17:28:32 - おお ３００００gぐらいで回せれば壁にベタっとついてくれたような気がする。

(無題) 削除/引用 No.9937-4 - 2021/09/29 (水) 14:08:29 - 硫安 >この培地のみに飽和硫安を加えて、同様のペレットができるか確認してみます。 培地には硫安沈殿で落ちてくるような物質はありませんでした。 したがって、細胞から出てきた何かだと思います。 ご教授いただいたようにろ紙などで浮いているペレットを回収して、再溶解にトライしてみます。

(無題) 削除/引用 No.9937-3 - 2021/09/29 (水) 11:51:59 - 硫安 >qq様 おっしゃる通りで、別のものが塩析している可能性がありますね。 ご意見を参考にチューブをよく見てみると、最上層にずっと浮いているものと、溶液中を漂っているものと、ちゃんとペレットになっているものもあります。 ExpiCHO systemには専用の培地が必要で、それに何が含まれているのかはHPを見る限りわかりませんでした。 この培地のみに飽和硫安を加えて、同様のペレットができるか確認してみます。 たいへん参考になりました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9937-2 - 2021/09/29 (水) 11:34:03 - qq 硫安で比重の小さい油のような分子が塩析されているような気がします。 胆汁酸やtweenのような消泡剤などが添加されていないかなぁ？ 遠心した後、浮いているものをガーゼのようなものでフィルターして、そのフィルタをPBSか何かで洗えば、回収できるのではないでしょうか？ しかし、発現させた分子のほうは、遠心チューブに沈殿しているかもしれませんのでお気を付けください。

硫安のペレットがバラバラに浮く 削除/引用 No.9937-1 - 2021/09/29 (水) 11:20:21 - 硫安 いつも勉強させていただいています。 哺乳類細胞に発現させた30 kDくらいの組換え蛋白質を精製しようと考え、ExpiCHO発現系で蛋白質を発現させ、培養上清を回収しました。 硫安沈殿でボリュームを下げ、PBSで透析後、アフィニティー精製を予定しています。 まずは硫安沈殿で粗精製しようと、 飽和硫安を加えて（上清１：飽和硫安2）氷上で1時間静置後、10,000×g 4℃ 30min遠心したのですが、ペレットがバラけた感じで浮いてしまいます。 このバラバラに浮遊しているペレットを回収する良いアイデアはございませんでしょうか。 よろしくお願いします。

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