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(無題) 削除/引用 No.9943-5 - 2021/10/09 (土) 21:16:02 - ema お返事ありがとうございます。 細胞内染色を行う場合についての質問でした。固定のみではなく透過処理をしてしまうとオーバーナイトできないのかという疑問でした。 確かに翌朝の測定であれば通常通りの染色をおこないPBSで4℃オーバーナイトしておくのがベターのようですしそれなら予約時間を気にしなくてよいので助かります。 申しわけありません、いろんな事情があって質問させていただきました。できる限り周りに聞くことで解決すよう努めていきます。

(無題) 削除/引用 No.9943-4 - 2021/10/06 (水) 10:05:21 - おもいつかない 1点補足しますと、パラホルムアルデヒド溶液で固定を行う場合、その品質(特にpH)に注意するのがよろしいです。 4%パラホルムアルデヒドを作成したことのある方はご存じと思いますが、その過程でNaOHの添加が必要になります。ところが、このNaOHの量により、最終的なパラホルムアルデヒド溶液のpHが変化することに注意が必要です。なぜかというと、蛍光色素のなかにはpH感受性のものがあるからです。その代表的なもののなかに、GFPがあります。 私の過去の経験だと、ある研究者が遺伝子導入効率をFACSで確認したところ、うまく蛍光がみられず、「GFPがリークしてる!」と叫んでいたことがあります。データ上はGFPのシグナルが低下しているのですが、それがなぜリークと断定できるのか謎でした。実際には、この研究者はFACS前に自家製のパラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定していたのですが、それが原因であり、試しに市販のパラホルムアルデヒド溶液を使ったところ、GFPのシグナル低下はわずかになりました。 GFPは一般的にプロトン感受性で、溶液がpH7より下に振れると蛍光を失うようです。以下のウェブページが参考になります。 https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/molecular-probes-school-of-fluorescence/imaging-basics/labeling-your-samples/labeling-using-fluorescent-proteins.html

(無題) 削除/引用 No.9943-3 - 2021/10/06 (水) 09:54:55 - おもいつかない PE-Cy7などのタンデム標識は、タンデムでない標識より不安定なことが多いです。具体的には、長時間の露光、長時間のパラホルムアルデヒド固定、低温(氷点下)などにより劣化します。固定してはいけないのではなく、固定液の中に漬けっぱなしにしてはいけないのです。 対策： パラホルムアルデヒド固定を 15 分間行い、遠心洗浄して PBS (0.2% BSA含有)に再懸濁し、4℃オーバーナイト保管する。 上記の固定液のパラホルムアルデヒド濃度は通常、0.5〜1%です。4%は必要ありません。 なお、細胞内染色の途中、cytofix/cytoperm に漬けたままオーバーナイトは、同様の理由で推奨はされません。必要なら遠心洗浄し、perm wash に再懸濁してから保管のほうがいいです。ただし、少し頑張って細胞内染色まで終わらせた後、PBS (0.2% BSA含有)に再懸濁し、4℃オーバーナイト保管するほうがベターです。 以下のウェブページも参考になります。 https://www.biolegend.com/ja-jp/blog/a-guide-to-tandem-dyes-and-degradation

(無題) 削除/引用 No.9943-2 - 2021/10/01 (金) 16:54:28 - ema 教室では今まで固定して測定の方が居なくて「フロ子」さまのみが固定で細胞内染色を希望していると解してお返事します。 ＞実際の固定はBDのcytofix/cytopermを固定に使用 を持っていること自体が教室で行っている方がいらっしゃると思うのですが。 細胞内染色ではなく、表面抗原のみの染色でしたら透過処理は必要ありませんし、細胞ダメージによる要らない光が検出されますので、固定のみが良いと思います。 試薬が分かりましたのでWebでのマニュアルを拝見させていただき、 P10 の　5の項目が近いのではないかと思います。 自身の研究では、表面抗原色素で先に染めて4% para固定を（提示のマニュアルと違う順番）し、冷暗所で次の日くらいまでは検出を行っていました。 知識のアンバランさを感じます。教室の先生、先輩にもっと聞いてください。良い教本はWebでも十分手に入ります。

FACSverse、検体の固定 削除/引用 No.9943-1 - 2021/10/01 (金) 13:42:51 - フロ子 失礼します。 FACS verseをタンデム色素を用いて使用しています。 施設利用時間が限られているので、前日固定して翌朝などの測定を考えています。ただ仕様書にはタンデム色素はホルムアルデヒドで固定しないと書いており、どうしたものかと考えております。 また実際の固定はBDのcytofix/cytopermを固定に使用しています。これは透過処理も行っているので、純粋にこのまま4度保存はしてはいけないのでしょうか。 もしご存じの方おられればご教授いただければ幸いです。

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