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(無題) 削除/引用 No.9975-7 - 2021/10/15 (金) 11:03:59 - おお すでに指摘がいくらか上がっていますが、こういうすでに樹立している実験とかは実験結果にどこが悪いか語らせるようにしないと何をやっているのかわからなくなってしまいます。 各ステップ確認しながらやっていくといいです。 コンピテントは十分な効率のものを使っているか？ ーインタクトのプラスミドをTransformationしてみる。 Ligationがワークしているか。 ーシングルカットのプラスミドLigationしたものとしてないもので比べる。 Double digestionで両方の酵素が聞いているか。 ー２つチューブを用意して、両方の酵素単独で切ってみる、切れていたらそれをつかってもう一方の酵素できる。 結果がいい悪いというのがわかりやすいこういう実験ではまだマシだが、結果が出てもうまく行ったか結果だけ見ても判断できないような実験をやるときこういう思考がないと研究にならなくなってしまいます。 あと、DNAをゲルから切り出すときUVを当てると結構だめになります。銀紙でおおってレーンの端だけ当てるとか工夫するといいです。

(無題) 削除/引用 No.9975-6 - 2021/10/15 (金) 10:48:23 - うりゃ ラボに貴方より詳しい人はいないのですか？

(無題) 削除/引用 No.9975-5 - 2021/10/14 (木) 18:28:13 - ぽー 根本的なことを確認したいのですが、コロニーPCRにM13プライマーしか入れていないんですか？ （エメラルドが何なのかも不明ですが、きっとTAKARAのやつでしょう）

(無題) 削除/引用 No.9975-4 - 2021/10/14 (木) 18:04:23 - G25 コロニーPCRではなく、あきらかにライゲーション、形質転換の問題（なのになぜタイトルが「コロニーPCR」）。 コロニーPCRのことはいいから、PCRから形質転換までの手順をもっと詳しく書いたほうがいい （いろいろオプションがあるところなのに、漠然としたことしか書いていない）。 ・PCRの酵素はどういうの？ ・PCR産物の出来は？（泳動像でシングルバンドだったか、プライマーダイマーはなかったかとか） ・PCR産物の精製ってどうやったの？ ・ベクターとの連結はどういう戦術（blunt end, TA-cloning, 制限酵素切断末端） ・ベクターの情報（pLitEはオーソドックスではないので、そう言われてもわからない人が大部分だと思うし、検索したけどみつからなかった）

(無題) 削除/引用 No.9975-3 - 2021/10/14 (木) 13:58:14 - AA pLiTEプラスミドの詳細を知らないのでわかりませんが、インサートを抜いて同様の操作をした場合はコロニーは生じないことを確認していますか？ セルフライゲーションのコロニーばかりを拾っているのかもしれません。 原因と直接関係無いかもしれませんが、私がやるときはライゲーション後はエタ沈を挟まずそのまま形質転換します。 またコロニーPCRは想定と違う長さの産物が得られることがよくあるので、コロニーすべてがそうなる場合は一度プラスミドにして確認します

(無題) 削除/引用 No.9975-2 - 2021/10/14 (木) 13:57:25 - noname ligationの後のエタ沈はいらないかも

コロニーPCR 削除/引用 No.9975-1 - 2021/10/14 (木) 13:32:28 - ばった 環境昆虫学を勉強している大学生です。 現在、Dicerの機能を調べる実験を行なっています。 まず、500bpのDicerの遺伝子をPCRによって増幅し、精製したのちにエタノール沈殿を行いました。次に、Dicerをインサート、pLitEをベクターとしてライゲーションを行い、エタノール沈殿を行いました。そして、top10をコンピテントセルとして用いてトランスフォーメーションを行い、プレートで培養しました。生えてきたコロニーを使ってコロニーPCRを、酵素にエメラルド、プライマーにM13を用いて行ったのですが、100bp以下のバンドしか出ず、当たりのバンドが出ません。(ちなみに、当たりのバンドってこの場合、インサートの500bp+M13プライマーの長さで合ってますか。)何度やっても同じ結果になります。 原因と改善策がわかる方いましたら、是非教えていただきたいです。

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