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spheroidの3D imagingについて トピック削除
No.9976-TOPIC - 2021/10/15 (金) 10:42:40 - 大学院生A
いつも勉強させていただいております。

大学院の研究で、間質細胞をmainとした 500μm程度のspheroidを作成しています。
機能評価としてwholeで蛍光免疫染色を行い, 3D imagingにてspheroid内の染色部位の局在を評価しています。

手技としては、以下の論文を参考にしております。
[High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids, Nature protocols, 2019]
大まかなprotocolとしては、

@　4% PFA over night
A　0.1% (vol/vol)PBS-Tween wash
B　1% PBS-Triton X-100 + 0.1M Glycerol + 10% FBS RT 1h
C　0.1% (vol/vol)PBS-Tween + 1% FBS + 1st Ab over night
D　0.1% (vol/vol)PBS-Tween wash x3
E　0.1% (vol/vol)PBS-Tween + 1% FBS + 2nd Ab RT2h or over night
F　0.1% (vol/vol)PBS-Tween wash x3
G　clearing solution (60% glycerol and 2.5M fructose) RT 20min
H　スライドグラス上に乗せ、周囲を細いテープで囲み、封入剤をいれカバーグラスをかけ
　　カバーグラスを下にして共焦点顕微鏡で観察。

（size の大きいspheroidのため本来であればLight Sheet 顕微鏡での評価がよいと思いますが、
施設にないため、共焦点顕微鏡(SP8)を用いて3D imagingを行なっています。）

この系にて実験を行っていますが、spheroid内部の細胞が抗体およびDAPIで染まりません。最外層から5層程度までは染色されています。Triton濃度を2％に上げましたが、内部まで染色されませんでした。
なお、同様のspheroidを凍結切片にてHE染色を行うと, しっかりと内部まで細胞を認めております。

サイズの大きいspheroidや組織をWholeで染色し3D imagingを行う際に、抗体を組織内部まで浸透させる方法があればご教授いただきたく質問をさせていただきました。
　
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(無題) 削除/引用
No.9976-2 - 2021/10/20 (水) 22:03:35 - toto
おそらくwhole tissue IFに近い状態と思いますので、固定後、SDSにつけて脂質を溶かして、あとは３以降、Tritonに置き換えてやれば、大分改善すると思います。もちろん細胞内部の微細構造はかなりやられますが、どこの細胞で何が発現しているかくらいは十分判定がつくと思います。SDSの濃度と時間はいくつか条件をふって試してみるしかないです。

spheroidの3D imagingについて 削除/引用
No.9976-1 - 2021/10/15 (金) 10:42:40 - 大学院生A
いつも勉強させていただいております。

大学院の研究で、間質細胞をmainとした 500μm程度のspheroidを作成しています。
機能評価としてwholeで蛍光免疫染色を行い, 3D imagingにてspheroid内の染色部位の局在を評価しています。

手技としては、以下の論文を参考にしております。
[High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids, Nature protocols, 2019]
大まかなprotocolとしては、

@　4% PFA over night
A　0.1% (vol/vol)PBS-Tween wash
B　1% PBS-Triton X-100 + 0.1M Glycerol + 10% FBS RT 1h
C　0.1% (vol/vol)PBS-Tween + 1% FBS + 1st Ab over night
D　0.1% (vol/vol)PBS-Tween wash x3
E　0.1% (vol/vol)PBS-Tween + 1% FBS + 2nd Ab RT2h or over night
F　0.1% (vol/vol)PBS-Tween wash x3
G　clearing solution (60% glycerol and 2.5M fructose) RT 20min
H　スライドグラス上に乗せ、周囲を細いテープで囲み、封入剤をいれカバーグラスをかけ
　　カバーグラスを下にして共焦点顕微鏡で観察。

（size の大きいspheroidのため本来であればLight Sheet 顕微鏡での評価がよいと思いますが、
施設にないため、共焦点顕微鏡(SP8)を用いて3D imagingを行なっています。）

この系にて実験を行っていますが、spheroid内部の細胞が抗体およびDAPIで染まりません。最外層から5層程度までは染色されています。Triton濃度を2％に上げましたが、内部まで染色されませんでした。
なお、同様のspheroidを凍結切片にてHE染色を行うと, しっかりと内部まで細胞を認めております。

サイズの大きいspheroidや組織をWholeで染色し3D imagingを行う際に、抗体を組織内部まで浸透させる方法があればご教授いただきたく質問をさせていただきました。
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