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(無題) 削除/引用 No.9983-8 - 2021/10/21 (木) 18:58:25 - 774R >3種類のうち、2種類は有名な表面抗原とサイトケラチンなので、直接法でいいのではと考えております。残り一つはconjugateがないため、直接法にするのか、間接法にするのか迷っているのですが、 直接法と間接法を混ぜて使うとき、同じホストのものがあると、間接法で使う2次抗体が直接標識の1次抗体にも反応してしまうので、そこは気を付けてください。 例えば 1. Rb-direct488 2. Ms-direct568 3. Rb-2nd-Ab-647 とした場合、2nd-Ab-647が1.の直接標識した1次抗体も染めてしまうということです。 全て直接標識にするか、Ms, Rb, Rtなどの3種のホスト抗体を組み合わせるかですかね。

(無題) 削除/引用 No.9983-7 - 2021/10/19 (火) 01:29:46 - R >[Re:6] LLLさんは書きました : > > 直接法でまとめた方がいいのでしょうか？ 経験ですが、直接法だと撮影中のブリーチが思ったより早く、やっぱり基本的には二次抗体を使ったほうがいいんだなーと思ったことがあります。もちろん目的タンパクの発現量にもよると思います。 > 4重染色を行う予定です。 > 3種類の抗体を全て間接法だと、6種類の抗体を扱うことになるので、仮にホストの選択等、机上の理論はクリアするのしても、何かしらどこかに問題が出る気がしています。 3種類の抗体とDAPIで4色の組み合わせはごく一般的に行われていると思いますが、どんな問題があると思うのですか？蛍光色素の漏れ込みなどは、多分共焦点顕微鏡を使うと考えますが、各メーカーさんがすでにフィルターをセットしていると思いますが。 > 3種類のうち、2種類は有名な表面抗原とサイトケラチンなので、直接法でいいのではと考えております。残り一つはconjugateがないため、直接法にするのか、間接法にするのか迷っているのですが、こういう場合、とりあえずは抗体を自分でラベリングして、直接法で染色してみるくらいの感覚で実験を進めていいのでしょうか。 そのくらいの感覚でまずは1枚染めてみて観察して直接法でいけると思えば進めていけばいいでしょうし、だめだと思えば間接でいけばいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9983-6 - 2021/10/17 (日) 22:39:21 - LLL みなさん、ありがとうございます。 参考になりました。また確信が持てました。 4重染色を行う予定です。 3種類の抗体を全て間接法だと、6種類の抗体を扱うことになるので、仮にホストの選択等、机上の理論はクリアするのしても、何かしらどこかに問題が出る気がしています。 3種類のうち、2種類は有名な表面抗原とサイトケラチンなので、直接法でいいのではと考えております。残り一つはconjugateがないため、直接法にするのか、間接法にするのか迷っているのですが、こういう場合、とりあえずは抗体を自分でラベリングして、直接法で染色してみるくらいの感覚で実験を進めていいのでしょうか。 間接法はシグナルが強いという話もあるのですが、バックグランドが高くなったり、様々なステップを踏んでいるうちに、退色が進む等、4重染色ではリスクになる気もします。 直接法でまとめた方がいいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9983-5 - 2021/10/17 (日) 21:40:03 - toto ええ、スペクトル的にはたいして変わらないのですが、分子輝度が4倍ほど違います。Alexa Fluor　の　Wikiにありますが、555は量子収率が0.1と、蛍光色素にしてはかなり低く、568はこれに対して0.69と優秀です。分子吸光係数は555のほうが2倍くらい高いですが、輝度全体としては、結局、555が15.5で、568が60.7になります。 十分明るいサンプルを免染で見てる場合にはほぼ気がつかないですが、暗いものをシビアに見たり、超解像やphotophysicsを調べたりする場合は、568のほうがだいぶ優秀です。 もう一つ、photostabilityが555は悪いというデータがあったと思うのですが、論文が出てきません。

(無題) 削除/引用 No.9983-4 - 2021/10/17 (日) 21:00:32 - 横から質問 totoさん ＞555は今では使うメリットはほとんどないと思います。 とは、どのような理由によるのでしょうか？ 私自身は555か568かはそれこそ顕微鏡のフィルター特性次第だと思い、使う予定の顕微鏡により敢えて使い分ける時もありますが、多くの場合は（標準的なフィルターセットの場合）大差ないと思っていました。 488との漏れ込みが少ない点は568の方が良いのでしょうが、逆に647とは555の方が良さそうですし、555を使うメリットがほとんどないと言えるぐらいに568の方が大きく優れているところはあるのでしょうか？ 568の方が555よりもそもそも明るいなど、何か違いがあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9983-3 - 2021/10/17 (日) 14:47:16 - toto 555は今では使うメリットはほとんどないと思います。568と647は普通に使ってますが、特に問題は感じません。もちろんある程度のcrosstalkはありますが。

(無題) 削除/引用 No.9983-2 - 2021/10/17 (日) 10:08:36 - 774R そのページに書かれてるとおりです。 重なりがあるからお勧めしませんということです。 だだし不可とは書いてありませんよね。使い方次第です。 顕微鏡のフィルターやダイクロッックミラーの特性により蛍光の被り具合が変わります。励起波長に被りが無い様に見えても、完全に0というわけではないし、励起光もその波長で完全にカットされるわけではありません。わずかに蛍光が被る可能性があります。 ただし、各蛍光色素のシグナルの強さと主張したい内容によっても問題が出たり出なかったりします。短波長の色素の蛍光が超波長側の観察時に漏れてくることはありますが、逆はほとんどありません。 また、僅かな漏れがあったとしても、相対的に弱ければ結論に影響を与えない場合もあります。 共局在を示す場合は漏れの影響の可能性が棄却できないことが問題となりますが、局在が別だと示すなら大丈夫でしょう。

多重染色での蛍光色素の選択 削除/引用 No.9983-1 - 2021/10/16 (土) 18:25:17 - LLL Alexa3種類とDAPIの4重染色を考えております。 つまり、DAPI、Alexa 488, 555or568, 647の組み合わせです（波形を見て555より568を第一に考えております）。 下記のページを見ると488と555及び568と647の組み合わせは、注意が出ているのですが、波形を見ると、最大ピークの励起波長にオーバーラップは全くありません。何故使用しない方がいいのでしょうか？ abcam.co.jp/secondary-antibodies/double-and-triple-immunostaining-using-secondary-antibodies 上記の組み合わせ、何か問題でしょうか？パラフィンブロックでの染色の予定です。

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