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(無題) 削除/引用 No.1022-20 - 2012/10/19 (金) 09:21:06 - qq ＞転写後にブロッキングしてから、５分ぐらい ＞風乾してからPVDFメンブレンを、第１抗体で ＞オーバーナイトインキュベーション No.1022-15 の件だと思いますが、ミリポアの説明をよく読んで、行われることです。おそらく、転写後のPVDFをブいっさいブロッキングしないで行います。 おおさんと同様に私もやったことはない。

(無題) 削除/引用 No.1022-19 - 2012/10/18 (木) 22:07:31 - おの 組織をホモジネートして抽出したタンパクを 昔なら10ugとか20ugぐらいロードしてミニゲ ル泳動してPVDFに転写してECLで検出していま した。 転写効率、メンブレン、ECLなどいろいろな改 善で、検出がよくなりすぎて、バックグラウンド が出やすくなってしまったと感じています。 今では、昔の１０分の１の１ugしかロードしない ようになっています。 論文で書くときには、ロードした蛋白量が１ug だけとか明記するとクレームが来そうなので、 ぼかして書かないようにしています。 （杞憂でしょうか？） ここでの話を基にして、 転写後にブロッキングしてから、５分ぐらい 風乾してからPVDFメンブレンを、第１抗体で オーバーナイトインキュベーションしてみよう かと思います。

(無題) 削除/引用 No.1022-18 - 2012/10/18 (木) 10:52:04 - おお >[Re:15] おおさんは書きました : > >[Re:14] Atailさんは書きました : > > > > トランスファー後故意に乾燥させてます。。。 > > > > 理由を教えて頂けませんか？我が現ボスはニトロセルロース一択で、ブロッキング剤の吸着促進のためトランスファー後の乾燥を勧めてきます。同じ理由でしょうか。当方それまでPVDFしか使ったことがなく、絶対に乾燥させてはいけないと学生時代教わったので、少々驚きです。 > > Ponceau S染色で、タンパクのないところははじくのでバックがでないからです。ほかの染色でもこのては使えるかもしれません。染色後メタノールにつけてもう一度活性化します。 > ああ、あとくわえて、Ponceau S染色液を乾燥したメンブレンにかけるので再利用しても使っているうちに薄くなってくるということがありません。

(無題) 削除/引用 No.1022-17 - 2012/10/18 (木) 01:11:33 - おお ニトロセルロースはflammable扱いで、flammableキャビネットなどに保存しないといけないんでしたっけ。。。

(無題) 削除/引用 No.1022-16 - 2012/10/17 (水) 17:05:47 - おお 支持体なしのニトロセルロースはバックとかに入れるとか(抗体溶液量をへらすために)、する時はちょっと苦労するかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1022-15 - 2012/10/17 (水) 17:01:33 - おお >[Re:14] Atailさんは書きました : > > トランスファー後故意に乾燥させてます。。。 > > 理由を教えて頂けませんか？我が現ボスはニトロセルロース一択で、ブロッキング剤の吸着促進のためトランスファー後の乾燥を勧めてきます。同じ理由でしょうか。当方それまでPVDFしか使ったことがなく、絶対に乾燥させてはいけないと学生時代教わったので、少々驚きです。 Ponceau S染色で、タンパクのないところははじくのでバックがでないからです。ほかの染色でもこのては使えるかもしれません。染色後メタノールにつけてもう一度活性化します。 ミリポアでは、PVDFを乾燥させてそのまま1次抗体につけてWBを始めると、タンパクが吸着してないところははじくのでバックがきれいになるという方法を紹介しています。わたしはそれはやってませんけど。特殊な方法なのでためしたいと思いでしたら一度プロトコールや注意点など確認してからされるといいかもしれません。 わたしはbioradのPVDFで乾燥した状態でWBをやろうとしたら、O/Nで抗体処理したのだったとおもいますが、徐々に水分が浸透して、最後にはメタノールを通したのと変わらない状態になってました。ミリポアのPVDFが特殊なのかどうかは分かりませんけど。。。

(無題) 削除/引用 No.1022-14 - 2012/10/17 (水) 16:10:39 - Atail > ニトロセルロースって、使った事が無いのですが、 > 本当に破けやすくて、初学者向きではないですか？ 確かにPVDFと比べれば破れやすいと感じますが、かと言って初学者向きでないということは無いと思います。私の場合、つい注意を怠って、ピンセットでつまんだ角を欠けさせてしまうことがありますが。。PVDFではこのようなことは経験したことはありません。 > トランスファー後故意に乾燥させてます。。。 理由を教えて頂けませんか？我が現ボスはニトロセルロース一択で、ブロッキング剤の吸着促進のためトランスファー後の乾燥を勧めてきます。同じ理由でしょうか。当方それまでPVDFしか使ったことがなく、絶対に乾燥させてはいけないと学生時代教わったので、少々驚きです。

価格ではないけど 削除/引用 No.1022-13 - 2012/10/17 (水) 11:21:05 - mon 数年前、Western blotでのStrep-Tagの検出を試みて、PVDF膜ではダメで、Nitrocellulose膜(10年くらいしまってあった物）で出来た。メーカーにも確認した。理由は不明。Tagの疎水性が強いためPVDF膜にへばり付き抗体が結合出来ないのかなと思う。 回収率悪いし面倒なのでStrep-Tagを使うのやめた。

(無題) 削除/引用 No.1022-12 - 2012/10/17 (水) 02:05:57 - おお サポートがないやつは折り曲げると割れてしまいますよね。

(無題) 削除/引用 No.1022-11 - 2012/10/17 (水) 00:57:08 - おお >[Re:9] abcさんは書きました : > ニトロセルロースって、使った事が無いのですが、 > 本当に破けやすくて、初学者向きではないですか？ >[Re:8] abcさんは書きました : > メーカーのユーザーサポートがPVDF勧める理由は、次でした。 > > （１）吸着容量が多い。 > （２）破れにくいので、初学者に扱わせやすい。 最近のニトロセルロースは何か破けない(破けにくい)シートでサポートされているものもあり、そういう意味で扱いにくいとはいえないですねぇ。バイオラッドはそういうタイプのものを売ってます。他社も売っているのではとおもいますが。 > PVDFの欠点は、乾燥させては絶対にいけない事ぐらいですね、 > とも言われました。 トランスファー後故意に乾燥させてます。。。

(無題) 削除/引用 No.1022-10 - 2012/10/16 (火) 22:39:59 - (・_・) ニトロセルロース膜はPVDFと比べれば見た目多少弱っぽいかもしれないけど、常識の範囲でふつうに取り扱う限りにおいては、メーカーの人が言った破けやすいとかはちょっとオーバーな言い方かな。 リプロービングとかするならはPVDFと思う。NC膜でもできるかもしれないけど蛋白質が剥がれそう。あとblotの蛋白質染色はPVDFならクマシーでOKだけど、NC膜はポンソーとかアミドブラックのほう使うとおもう。あとPVDFだとrapid immunodetectionみたいな方法もあるし、けっこういろんな使い方できるかも。ブロットからのアミノ酸シーケンスはPVDFじゃないとできない（NC膜はシーケンスに使う試薬に耐性がないから）。 要は自分の実験目的に支障ないならどっちでもいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.1022-9 - 2012/10/16 (火) 20:30:50 - abc ニトロセルロースって、使った事が無いのですが、 本当に破けやすくて、初学者向きではないですか？

(無題) 削除/引用 No.1022-8 - 2012/10/16 (火) 20:27:26 - abc メーカーのユーザーサポートがPVDF勧める理由は、次でした。 （１）吸着容量が多い。 （２）破れにくいので、初学者に扱わせやすい。 当方、教官ですが、当方自身はウエスタンの経験があまり無いけど 学生に実施してもらう必要が生じた時に、聞いた時の話です。 PVDFの欠点は、乾燥させては絶対にいけない事ぐらいですね、 とも言われました。 その学生は、バックグラウンドの高さで悩んでいるので、 ニトロセルロースを選択してあげた方が良かったかと、反省してます。

(無題) 削除/引用 No.1022-7 - 2012/10/16 (火) 01:38:59 - (・_・) もともとニトロセルロース膜の方がずっと長く使われてきて、あとからPVDFが膜が出てきたんだよ、たしか。なのでニトロセルロース膜でも十分用が足りてたから、慣習的にそのまま使ってるひとも多いんじゃないかな。それにノーザンとかにも使えるし。両方使ってたことあるけどあるけどそんなに差があるようには感じない。吸着容量はPVDFの方がそれなりに高いかもしれないけど、PVDFでバックが高めになる抗体とかは、ニトロセルロース膜の方がBG低くてきれいなデータとれることが多い気がする。それと、聞いた話だけど、蛋白質によってはニトロセルロースの方が吸着しやすいものもあるらしい。

(無題) 削除/引用 No.1022-6 - 2012/10/15 (月) 10:02:41 - TS ＞でも、論文ではニトロセルロースを未だに使っている事が多いで す。なぜなのかいつも不思議に思っています。値段だけでは無いと 思います。ニトロセルロースを使う方は、どうしてPVDFを使わな いのでしょうか？ 人により、理由が異なるとは思いますが、 私の知人の一人は、「PVDFは、メタノールに漬けるひと手間があるでしょ。ほんとに小さい手間であることはわかってるんだけど。でもニトロセルロースで問題が出たことないから。」と言っていました。ScienceやNatureを何本も持っているような方です。

(無題) 削除/引用 No.1022-5 - 2012/10/15 (月) 08:04:28 - おお >[Re:3] abcさんは書きました : > メーカーのユーザーサポートに聞くと、PVDFをはじめに使う事を > 様々な理由で勧められます。 具体的にどういう理由でしょうか、タンパクの吸着のキャパシティーが高いのは存じ上げていますが。

(無題) 削除/引用 No.1022-4 - 2012/10/15 (月) 08:02:49 - おお >[Re:2] aaaaさんは書きました : > ニトロセルロースはPVDFの1/2くらいの値段です。 ありがとうございます。値段ぐらい自分で調べろっていわれそうな質問、付き合ってくれてありがとうございました。 >[Re:3] abcさんは書きました : > メーカーのユーザーサポートに聞くと、PVDFをはじめに使う事を > 様々な理由で勧められます。 > > でも、論文ではニトロセルロースを未だに使っている事が多いで > す。なぜなのかいつも不思議に思っています。値段だけでは無いと > 思います。ニトロセルロースを使う方は、どうしてPVDFを使わな > いのでしょうか？ ニトロセルロースで十分系がワークしていたからでないでしょうか。それで値段が高いとなると、あまり変えるメリットもないかもしれません。 ほぼside by sideで調べたことがありますが、PVDFのほうが若干バックグランドが高くなる傾向はあります。HRP以外の検出系であれば例えば蛍光色素とかの吸着せいとか、HRPでも感度が高くなってくるとバックグランドとの戦いみたいになってきますし、、、

(無題) 削除/引用 No.1022-3 - 2012/10/15 (月) 07:37:25 - abc メーカーのユーザーサポートに聞くと、PVDFをはじめに使う事を 様々な理由で勧められます。 でも、論文ではニトロセルロースを未だに使っている事が多いで す。なぜなのかいつも不思議に思っています。値段だけでは無いと 思います。ニトロセルロースを使う方は、どうしてPVDFを使わな いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1022-2 - 2012/10/15 (月) 07:20:28 - aaaa ニトロセルロースはPVDFの1/2くらいの値段です。

PVDF vs nitrocellulose 削除/引用 No.1022-1 - 2012/10/15 (月) 05:49:37 - おお どっちが安かったっけ。

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