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(無題) 削除/引用 No.1030-7 - 2012/10/19 (金) 11:37:05 - es >[Re:6] おおさんは書きました : 早速の御返答ありがとうございます。 > 抗体にもよるかもしれませんが、ウエスタンで使える抗体であれば、変性状態で検出できるわけですから、SDSやねつなどの影響で構造がほどけてしまっているほうが抗体のアクセスには有利なばあいもあるとおもいます。タンパク成分が多いと熱変性で溶けず沈殿してしまうようこともありそのような場合はべつですが、SDSを入れるわけですし、入れた抗体の濃度から察しがつきますし。1mg/ml程度で界面活性剤が入っているのであれば沈殿して変になることはあまりないかと。 確かにウエスタンで検出が行えてますので、変性状態でも免疫沈降には影響なくいけそうです。(実際は御指摘して頂いてるように抗体に依存するところが大きいと思いますが...) アドバイス頂いた点を参考に、実験を行いたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1030-6 - 2012/10/19 (金) 11:12:22 - おお >[Re:5] esさんは書きました : > > 高温で行う方が溶出効率は上がると思うのですが、実際60C程度でしたら抗原への影響(変性等)は大丈夫なものなのでしょうか?御存知でしたらお願いします。 > 抗体にもよるかもしれませんが、ウエスタンで使える抗体であれば、変性状態で検出できるわけですから、SDSやねつなどの影響で構造がほどけてしまっているほうが抗体のアクセスには有利なばあいもあるとおもいます。タンパク成分が多いと熱変性で溶けず沈殿してしまうようこともありそのような場合はべつですが、SDSを入れるわけですし、入れた抗体の濃度から察しがつきますし。1mg/ml程度で界面活性剤が入っているのであれば沈殿して変になることはあまりないかと。

(無題) 削除/引用 No.1030-5 - 2012/10/19 (金) 11:00:45 - es >[Re:4] おおさんは書きました : 御返答ありがとうございます。 > 一回目の抗体は変性している(変性が進んでいる)でしょうから、protein A/Gとの相互作用は弱くなっているとおもえます。 確かにその可能性は考えられますので、その点も検討で明らかに出来ればと思います。 > 溶出のときのSDSの濃度を0.1%ぐらいにして加温してやり(60度ぐらいとか)回収できればさらにSDSの濃度を下げることができればSDSの影響をかなり抑えることができると思いますが、、、 高温で行う方が溶出効率は上がると思うのですが、実際60C程度でしたら抗原への影響(変性等)は大丈夫なものなのでしょうか?御存知でしたらお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1030-4 - 2012/10/19 (金) 02:12:34 - おお >[Re:3] esさんは書きました : > > バッファー組成は > 50mM Tris-HCl(pH8.0) > 2mM EDTA > 167mM NaCl > 1.1% Tx100 ですので、SDSによる溶出が行えそうです。 > > > 溶出した物にはIgGが含まれていると思いますので、ビーズに目的の抗体をつけてから溶出した溶液に加えるといいかとおもいます。 > > 1回目の抗体の混入の懸念がありましたので、この方法で除去できるか溶出と共に早速検討したいと思います。 一回目の抗体は変性している(変性が進んでいる)でしょうから、protein A/Gとの相互作用は弱くなっているとおもえます。 SDSを最終濃度0.1%いかで、他のでタージェンとを含んでる場合(でタージェンと同士のの相互作用で、従来のSDSの強い変性作用がおさえられるようです)にのみIPが可能な抗体はありますが、これは抗体次第ですので、運かもしれません。あるいはそのような抗体をさがすか。 溶出のときのSDSの濃度を0.1%ぐらいにして加温してやり(60度ぐらいとか)回収できればさらにSDSの濃度を下げることができればSDSの影響をかなり抑えることができると思いますが、、、

(無題) 削除/引用 No.1030-3 - 2012/10/18 (木) 18:40:53 - es >[Re:2] おおさんは書きました : お返事の方ありがとうございます。 > 2回目の免疫沈降のバッファーの組成はなんでしょうか? > RIPAでSDSが入ったようなバッファーであれば、SDSを加えて溶出し、SDS抜きの免疫沈降バッファーをつくりSDSがもともとの濃度以下になるように希釈する手が取れるかもしれません。 バッファー組成は 50mM Tris-HCl(pH8.0) 2mM EDTA 167mM NaCl 1.1% Tx100 ですので、SDSによる溶出が行えそうです。 > 溶出した物にはIgGが含まれていると思いますので、ビーズに目的の抗体をつけてから溶出した溶液に加えるといいかとおもいます。 1回目の抗体の混入の懸念がありましたので、この方法で除去できるか溶出と共に早速検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1030-2 - 2012/10/18 (木) 00:42:42 - おお >[Re:1] esさんは書きました : > > 抗体A及びmagnetic beadsで免疫沈降後,beadsをwash > →beadsに10mM DTT/ミリQを25uL加え37C,30minで溶出 > →上清を回収し、DTT不含のbufferで希釈(40倍) > →抗体Bで免疫沈降　　になります。 経験はありませんが、、、 2回目の免疫沈降のバッファーの組成はなんでしょうか? RIPAでSDSが入ったようなバッファーであれば、SDSを加えて溶出し、SDS抜きの免疫沈降バッファーをつくりSDSがもともとの濃度以下になるように希釈する手が取れるかもしれません。 溶出した物にはIgGが含まれていると思いますので、ビーズに目的の抗体をつけてから溶出した溶液に加えるといいかとおもいます。 あるいは10mMDTTを免疫沈降用バッファーで行えば溶出力が水よりはあるかと思いますが、、、

re-chip時の溶出条件 削除/引用 No.1030-1 - 2012/10/17 (水) 17:49:09 - es いつも勉強させて頂いてます。 今回、皆様のお力を貸して頂いたくトピックを作成致しました。 現在、クロマチン免疫沈降(ChIP)を行っており、その過程でre-ChIPも行っているのですが、ここでの溶出条件で苦労しております。 現在のプロトコールはupstate社のChIPキットに準じて行っておりまして、溶出過程前後の詳細を書かせて頂きますと、 抗体A及びmagnetic beadsで免疫沈降後,beadsをwash →beadsに10mM DTT/ミリQを25uL加え37C,30minで溶出 →上清を回収し、DTT不含のbufferで希釈(40倍) →抗体Bで免疫沈降　　になります。 溶出条件につきましては同様の方法を行っている論文を参照したのですが、どうやらこの条件ではbeadsからの溶出が行えていないようでした。 (溶出後のbeadsをSDS-PAGEすると抗体Aの抗原が多量検出され、溶出液には何も検出されませんでした) DTT濃度に関しましては200mMまで濃度を上げ、また溶出時間に関しても2hrまで伸ばしてみましたが同様の結果でした。(これ以上はDTT濃度等が2回目の免疫沈降に影響しそうなので行っておりません) DTTに関しては購入後、ミリQにて1Mにした後、分注し-20Cで保存したものを使用しています。また、使用時には活性の低下が懸念されるので、融解させたものをその都度使用し、残ったものは再利用しないようにしています。 長文になり、また文章も拙く申し訳ありませんが、溶出条件に関して経験をお持ちの方、アドバイス頂けましたら幸いに存じます。

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